幽門螺桿菌甲硝唑耐藥的比較蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究.pdf

1、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H．pylori）是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，并與黏膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤（MALT）及胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，H．pylori感染嚴(yán)重危及人類的健康，因此，如何有效控制H．pylori感染亟需解決，但至今還沒有一種單一的抗生素可根除H．pylori感染，二聯(lián)抗生素療法對(duì)H．pylori的根除率也不高，目前，臨床抗H．pylori治療多采用在質(zhì)子泵抑制劑（PPI）或膠體鉍劑的基礎(chǔ)上加

2、兩種抗生素的三聯(lián)療法，常用抗生素包括甲硝唑（Metronidazole，MTZ）、克拉霉素（Clarithiomycin，CLA）、阿莫西林（Amoxicilin，AMX）。然而，近年來隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，H．pylori對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性呈上升趨勢(shì)，耐藥性的產(chǎn)生是根除H．pylori失敗的重要原因。 甲硝唑（Metronidazole，MTZ）是H．pylori三聯(lián)及四聯(lián)療法中常用的抗生素，屬于硝基咪唑類藥物，其本身為一種無

3、抑菌活性的藥物前體，需在細(xì)胞內(nèi)被硝基還原酶激活后才能發(fā)揮滅菌作用。由于MTz在人體內(nèi)具有活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)及價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，因而成為根除H．pylori感染的首選藥物之一，然而，MTZ的耐藥率在幾種治療H．pylori的抗生素中居高，H．pylori對(duì)甲硝唑的耐藥降低了包含有MTZ治療方案的療效，從而成為根治H．pylori失敗的重要原因。目前主要認(rèn)為：H．pylori通過基因突變或基因表達(dá)調(diào)控，使作用于細(xì)菌的硝基還原酶含量降低，從而阻止

4、或抑制MTZ轉(zhuǎn)化為使細(xì)菌致死的還原產(chǎn)物，最終導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)藥物的耐受。大多數(shù)研究推斷甲硝唑耐藥可能與rdxA、frxA、fdxB基因突變密切相關(guān)，它們分別編碼氧不敏感的NADPH硝基還原酶、NADPH黃素氧化還原酶和鐵氧還原蛋白類似物。但也有研究者發(fā)現(xiàn)這些基因在部分敏感株和耐藥株中的表達(dá)一致，這提示MTZ耐藥株的形成過程中可能存在其它基因的參與，因此有必要進(jìn)一步研究H．pylori對(duì)MTZ耐藥的新機(jī)制。 研究H．pylori對(duì)甲硝唑

5、的耐藥機(jī)制實(shí)際上就是揭示藥物作用細(xì)菌后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制?；诨蚪M學(xué)技術(shù)的研究存在局限性，即使捕獲到細(xì)菌內(nèi)mRNA的信息仍不能代表基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的最終功能，這就需要我們從生命活動(dòng)的執(zhí)行者蛋白質(zhì)入手，研究藥物干預(yù)后蛋白質(zhì)種類及數(shù)量的變化。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究較為流行的技術(shù)體系是應(yīng)用雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、質(zhì)譜分析鑒定所分離的蛋白質(zhì)，應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行存儲(chǔ)、處理、對(duì)比和分析。幽門螺桿菌兩個(gè)菌株（H．pylori26695和H．py

6、loriJ99）的全基因組序列測(cè)序已經(jīng)完成，利用現(xiàn)有的生物信息學(xué)資源，本研究旨在通過高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)了解幽門螺桿菌在MTZ作用下由敏感株轉(zhuǎn)化為耐藥株的蛋白質(zhì)表達(dá)模式變化，為初步闡明幽門螺桿菌耐藥性的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。據(jù)此，我們主要做了以下工作： 1、幽門螺桿菌甲硝唑耐藥株的體外誘導(dǎo)和鑒定 體外培養(yǎng)幽門螺桿菌26695（H．pylori26695），并利用藥物濃度連續(xù)倍增的方法建立H．pylori26695甲硝唑耐藥株，

7、分別測(cè)定用藥前后甲硝唑?qū)．pylori26695的最低抑制濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC），MIC值變化≧32倍時(shí)被確定為誘導(dǎo)出對(duì)抗生素耐藥的菌株，為保證抗生素耐藥株的穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌5代后進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)，再測(cè)定其MIC值，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增rdxA基因并測(cè)序檢測(cè)其是否發(fā)生突變。本研究結(jié)果證明我們成功誘導(dǎo)出穩(wěn)定的H．pylori26695甲硝唑耐藥株，其對(duì)甲硝唑的耐受濃度為敏感株的25

8、6倍，經(jīng)回復(fù)實(shí)驗(yàn)?zāi)退幹甑腗IC值前后保持一致，rdxA基因測(cè)序結(jié)果顯示3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生插入突變，該工作為研究幽門螺桿菌對(duì)MTZ耐藥機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?2、幽門螺桿菌甲硝唑敏感株與耐藥株蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的構(gòu)建 分別收集H．pylori26695敏感株與耐藥株，提取細(xì)菌總蛋白，應(yīng)用等電聚焦電泳（IEF）將菌體蛋白質(zhì)在不同pH梯度進(jìn)行分離，然后用SDS—PAGE電泳技術(shù)根據(jù)分子量的不同在聚丙烯酰胺凝膠上電泳進(jìn)一步分離；通過雙

9、向凝膠電泳（2—DE）技術(shù)分離菌體蛋白，蛋白質(zhì)顯色使用銀染法，用掃描儀獲取蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜，利用ImageMastet2DElite軟件進(jìn)行圖像分析，尋找敏感株與耐藥株的差異性蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在H．pylori耐藥株中有55個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)差異顯著。 3、幽門螺桿菌甲硝唑敏感株與耐藥株的差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定 利用基質(zhì)輔助激光解吸電離—飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI—TOF—TOF）對(duì)表達(dá)差異性的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MAlD

10、I—TOF—TOF質(zhì)譜分析，共得到24個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的可靠信息，23個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在耐藥株中的表達(dá)升高，1個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在耐藥株中表達(dá)降低。通過網(wǎng)絡(luò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www．matrixscience．com and http：//www．expasy．ch/tools/peptident．htm）搜索對(duì)比后，這些蛋白質(zhì)分別涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、合成與代謝以及壓力反應(yīng)等生物學(xué)功能。本研究結(jié)果提示H．pylori26695甲硝唑耐藥株的形成涉及到多