兒童感染幽門螺桿菌甲硝唑耐藥狀況及rdxA、frxA基因在耐藥機(jī)制中作用的研究.pdf

1、幽門螺桿菌(HelicobacterPylori，H.pylori)是全球最常見的病原體之一，是成人慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，并與某些胃癌和胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織(Mucosa-AssociatedLymphoidTissue，MALT)淋巴瘤密切相關(guān)，根除H.pylori能有效的控制了消化性潰瘍的發(fā)生和再發(fā)，并可使部分MALT淋巴瘤自行消退。兒童一旦感染H.pylori難以自行清除，不僅僅導(dǎo)致慢性胃炎和消化性潰瘍，還可以導(dǎo)致鐵缺乏

2、甚至缺鐵性貧血和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等；有學(xué)者認(rèn)為根除兒童感染H.pylori有助于阻斷或延緩胃粘膜萎縮和腸化的發(fā)展從而控制胃腺癌、胃MALT淋巴瘤的發(fā)病率。甲硝唑(Metronidazole，MTZ)以其用藥后胃部濃度高、對(duì)胃酸穩(wěn)定且抑菌濃度與殺菌濃度接近的優(yōu)點(diǎn)，是目前推薦的根除方案中重要組成藥物之一。隨著MTZ在人群中的應(yīng)用，H.pylori對(duì)MTZ的原發(fā)和繼發(fā)耐藥株(MTZR)的出現(xiàn)導(dǎo)致了耐藥率逐年迅速上升、含MTZ的方案根除率下降甚至根

3、除失敗。對(duì)兒童感染H.pylori的MTZ耐藥狀況變化特點(diǎn)及耐藥機(jī)制的探討迫切而重要，但國(guó)內(nèi)缺乏相應(yīng)的研究；此中適用于MTZ的MIC判斷方法有爭(zhēng)議，本研究將一并進(jìn)行探討。 44株(2002年10月～2004年1月間)與83株(2004年12月～2005年7月間)的H.pylori臨床菌株，分別來(lái)自此期間因上消化道癥狀在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院行胃鏡檢查的患兒胃竇部粘膜。胃竇粘膜標(biāo)本勻漿后接種于含有選擇性抗生素的培養(yǎng)基，37℃微

4、需氧環(huán)境(5％O2，15％CO2和80％N2)培養(yǎng)3天，選用形態(tài)單一的針尖大小透明菌落同步進(jìn)行尿素酶、過(guò)氧化氫酶(觸酶)和氧化酶鑒定陽(yáng)性，并經(jīng)Gram染色為陰性彎曲桿菌(海鷗狀或“S”型)者定為H.pylori菌株。以瓊脂稀釋法為準(zhǔn)測(cè)定所有H.pylori菌株的MIC值，以MIC＞8.0mg/L為耐藥，同時(shí)以E-test方法測(cè)定其中55株MIC值。隨機(jī)選出11株野生MTZS菌株及其對(duì)應(yīng)的獲得性MTZR株RAPD-PCR基因指紋檢測(cè)，并對(duì)

5、其中9株野生MTZS菌株及其對(duì)應(yīng)的獲得性MTZR株和5株隨機(jī)選擇的野生MTZR株(MIC≥256mg/L)的rdxA、frxA基因測(cè)序分析，采用DNAMAN5.2.2軟件、以H.pylori標(biāo)準(zhǔn)株26696序列中rdxA基因(HP0954)和frxA基因(HP0642)定位堿基序列。 結(jié)果顯示：(1)2002～2004年組和2004～2005年組H.pylori的MTZ耐藥率分別為31.82％和51.81％(P=0.031)，M

6、IC值范圍分別是＜0.125～128mg/L和0.25～＞256mg/L，MIC50、MIC90值分別為0.5mg/L、128mg/L和16mg/L、128mg/L；上述結(jié)果顯示耐藥率和MIC50呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。(2)相對(duì)于瓊脂稀釋法，E-test法對(duì)H.pylori的MTZ藥敏的判斷敏感性73.08％、特異性100％，二者符合率87.27％，相關(guān)性良好(x2=32.38，P＜0.001)，但在兩方法對(duì)照的所有55株對(duì)應(yīng)MIC值中，28株

7、有22～26個(gè)數(shù)量級(jí)以上差別，提示E-test法用于MTZ敏感性判斷時(shí)可能需要加做瓊脂稀釋法以防MTZR株漏診。(3)11株野生MTZS株與對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)MTZR株中，8株RAPD-PCR指紋一致，3株有一條以上主要條帶差別；但無(wú)論指紋圖一致與否，其rdxA基因和frxA基因均能擴(kuò)增出大小相當(dāng)?shù)腄NA片段，且誘導(dǎo)耐藥前后序列間高度同源(分別為rdxA基因序列99.45％±0.30％同源，frxA基因序列99.24％±0.33％同源)。表明在

8、體外MTZ誘導(dǎo)下，野生MTZS株變成獲得性MTZR株可能源于其基因組序列發(fā)生了起始突變，但RAPD-PCR指紋變化不能鑒別耐藥與否，有必要進(jìn)一步對(duì)rdxA基因和frxA基因進(jìn)行測(cè)序分析。 對(duì)所有菌株的基因分析發(fā)現(xiàn)：野生MTZS菌株rdxA基因和frxA基因與標(biāo)準(zhǔn)株同源性分別為94.47％～95.89％(95.00％±0.16％)和94.04％～95.54％(94.71％±0.16％)，序列中堿基插入或缺失所致Gap分別為0處和0

9、～7(1.44±0.78)處；對(duì)應(yīng)的獲得性MTZR株rdxA基因序列和frxA基因序列與野生MTZS株同源性分別為97.63％～100％(99.45％±0.30％)和97.14％～100％(99.24％±0.33％)，新發(fā)Gap分別為0~1(0.33±0.17)處和0～6(1.78±0.66)處；rdxA基因和frxA基因分別1株和2株MTZS株誘導(dǎo)耐藥前后無(wú)新發(fā)突變。獲得性MTZR株rdxA基因新發(fā)點(diǎn)突變(PointMutation)

10、共計(jì)34處，其中堿基插入1處、缺失2處，點(diǎn)突變引起的堿基替代31處，替代以轉(zhuǎn)換(嘌呤換嘌呤或嘧啶換嘧啶)為主(Y占15/31，R占11/31)；未見新發(fā)多點(diǎn)突變(MultipleMutation)。獲得性MTZR株frxA基因共計(jì)新發(fā)點(diǎn)突變52處，其中堿基插入15處、缺失3處，點(diǎn)突變引起的堿基替代34處，替代以轉(zhuǎn)換為主(Y占17/34，R占11/34)；新發(fā)多點(diǎn)突變2處。隨機(jī)選出的5株野生MTZR株中，rdxA基因和frxA基因與H.p

11、ylori標(biāo)準(zhǔn)株26695序列同源性分別為94.44％～95.42％(95.06％±0.20％)和93.88％～98.77％(95.29％±0.89％)，序列中原有Gap分別為0～3(1.6±0.6)處和0～1(0.40±0.24)處。5株野生MTZR株rdxA基因共計(jì)原有點(diǎn)突變139處，其中堿基插入2處，點(diǎn)突變引起的堿基替代137處，替代以轉(zhuǎn)換為主(R占64/137，Y占53/137)；原有多點(diǎn)突變12處，其中堿基缺失2處、堿基替代1

12、0處。5株野生MTZR株frxA基因共計(jì)原有點(diǎn)突變155處，其中堿基缺失2處，點(diǎn)突變引起的堿基替代153處，替代以轉(zhuǎn)換為主(R占65/153，Y占58/153)；未見原有多點(diǎn)突變。獲得性MTZR株rdxA基因31處新發(fā)點(diǎn)突變堿基替代中，12處與野生MTZR株原有替代位點(diǎn)與類型一致，1處堿基替代位點(diǎn)相同但類型不同，1處單堿基插入對(duì)應(yīng)野生MTZR株替代位點(diǎn)，其余堿基替代或堿基插入、缺失位點(diǎn)與數(shù)目間各不相同。獲得性MTZR株frxA基因34處

13、新發(fā)點(diǎn)突變堿基替代中，16處與野生MTZR株原有替代位點(diǎn)與類型一致，1處堿基缺失位點(diǎn)及類型一致，1處堿基替代位點(diǎn)對(duì)應(yīng)，另有6處新發(fā)單堿基插入和缺失位點(diǎn)與野生MTZR株原有堿基替代位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，其余堿基替代及插入、缺失位點(diǎn)并不對(duì)應(yīng)；獲得性MTZR株frxA基因1處新發(fā)多點(diǎn)突變對(duì)應(yīng)野生MTZR株DNA序列中原有單堿基替代位點(diǎn)。上述結(jié)果表明，rdxA基因和frxA基因突變常常是多位點(diǎn)、多類型隨意發(fā)生，其突變位點(diǎn)和類型與H.pylori的MTZ耐

14、藥程度的相關(guān)性還需進(jìn)一步大量深入研究；有意義的是，rdxA基因和frxA基因分別1株和2株MTZS株誘導(dǎo)耐藥前后無(wú)新發(fā)突變，提示可能存在該二基因突變之外的MTZ耐藥機(jī)制。 綜上，本研究得出結(jié)論：1.本地區(qū)兒童感染H.pylori對(duì)MTZ的耐藥率呈升高趨勢(shì)；2.E-test法判斷H.pylori對(duì)MTZ敏感性時(shí)，建議加做瓊脂稀釋法以防MTZR株漏診；3.rdxA基因和frxA基因突變常為多位點(diǎn)、多類型隨意發(fā)生；4.H.pylori