Genistein抑制關(guān)節(jié)軟骨退化及作用機制研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎是一種發(fā)病率高、嚴(yán)重影響中老年人群生活質(zhì)量的慢性退行性疾病。主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨組織退化,發(fā)病機制與基質(zhì)金屬蛋白酶與金屬蛋白酶抑制物比例失衡,局部炎性介質(zhì)產(chǎn)生增多,導(dǎo)致膠原纖維破壞、蛋白聚糖分解代謝增強有關(guān)。植物化學(xué)物質(zhì)Genistein屬于黃酮類化合物,具有較強抗氧化、抗炎癥反應(yīng)能力,對關(guān)節(jié)軟骨細胞炎性損傷有一定的保護作用。
　　 目的:本研究擬通過兔關(guān)節(jié)軟骨細胞的體外培養(yǎng),并采用脂多糖干預(yù)誘導(dǎo)兔軟骨細胞損傷,以建立

2、體外模擬骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞生長模型。利用上述細胞模型,本研究將進一步觀察Genistein對經(jīng)LPS處理的軟骨細胞活性、炎癥因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用,以了解Genistein對軟骨細胞的保護作用及可能機制。
　　 方法:
　　 第一部分:選取一月齡新西蘭兔,處死后在無菌條件下切取兔脛骨近端、股骨遠端及近端關(guān)節(jié)面軟骨,采取機械分離結(jié)合酶消化結(jié)合的方法獲取足量軟骨細胞,培養(yǎng)子15％胎牛血清的DMEM高糖型培養(yǎng)基,倒置顯微鏡下觀察細胞

3、形態(tài)及生長狀況,并采用化學(xué)染色及免疫組化染色對軟骨細胞進行鑒定。用脂多糖處理細胞,MMT實驗測定軟骨細胞活性,并采用試劑盒、RT-PCR方法檢測軟骨細胞損傷過程中相關(guān)炎癥介質(zhì)一氧化氮(NO)、白介素-1β(IL-1β)的表達水平。
　　 第二部分:為進一步觀察Genistein對軟骨細胞的保護作用,穩(wěn)定傳代的細胞分為正常軟骨細胞組,脂多糖單獨處理組,脂多糖+雌激素處理組,脂多糖+不同劑量Genistein處理組(選取Genist

4、ein劑量為0.1μg/ml~25.0μg/ml)。根據(jù)MTY實驗繪制各組細胞生長曲線,比較軟骨細胞活性。提取各組細胞總RNA,經(jīng)RT-PCR實驗測定相關(guān)炎性介質(zhì)IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、Ⅱ型膠原、P53基因的表達。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:在成功建立體外關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上,采用脂多糖處理細胞,造成細胞炎癥損傷模型,細胞增殖活性降低,NO產(chǎn)生增多、IL-1

5、β表達增高,提示體外模擬骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞模型建立成功。
　　 第二部分:利用LPS誘導(dǎo)的體外關(guān)節(jié)軟骨細胞損傷模型觀察Genistein對軟骨細胞作用的實驗結(jié)果提示,LPS對軟骨細胞增殖活性產(chǎn)生顯著抑制作用。在處理早期,LPS能顯著刺激炎性介質(zhì)IL-1β表達,并通過提高iNOS表達增加NO水平,對MMP-1和P53表達也有促進作用。對LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖活性受抑,Genistein未表現(xiàn)明顯逆轉(zhuǎn)作用,高劑量條件下表現(xiàn)為抑制細

6、胞增殖活性作用。低劑量Genistein與雌性激素處理組炎性介質(zhì)IL-1β、iNOS、MMP-1、P53表達雖然仍高于正常軟骨細胞,但與LPS單獨處理相比,均表現(xiàn)為表達水平降低的特點。Ⅱ型膠原表達水平表現(xiàn)出穩(wěn)定甚至因為損傷因素呈現(xiàn)微弱增高的特點。
　　 結(jié)論:以脂多糖處理體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細胞能導(dǎo)致炎癥損傷,表現(xiàn)為細胞活性降低,炎性介質(zhì)產(chǎn)生增多,可作為研究骨關(guān)節(jié)炎的較為理想的體外細胞模型。LPS作為損傷因素對軟骨細胞增殖活性產(chǎn)生

7、顯著抑制作用,結(jié)合對相關(guān)基因表達調(diào)節(jié)的結(jié)果,顯示了LPS在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、增加基質(zhì)降解和誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡方面的作用特點。對LPS已經(jīng)造成的軟骨細胞損傷,Genistein對細胞增殖活性未表現(xiàn)明顯逆轉(zhuǎn)作用,但從調(diào)節(jié)基因表達結(jié)果看,低劑量Genistein與雌性激素類似,表現(xiàn)出降低炎性介質(zhì)、減少iNOS生成、降低軟骨蛋白酶、抑制凋亡的特點。軟骨細胞特征性標(biāo)志物Ⅱ型膠原表達水平維持正?；蛭⑷踉龈叩奶攸c提示軟骨基質(zhì)降解破壞增強是OA病理過程中更為