LIPU對(duì)兔CFDBM負(fù)載關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及BMSCs的作用研究.pdf

1、在關(guān)節(jié)外科領(lǐng)域，關(guān)節(jié)軟骨損傷是一直是研究的重點(diǎn)之一，目前尚無(wú)有效的治療方法。由于關(guān)節(jié)軟骨本身無(wú)神經(jīng)支配、缺乏血液供應(yīng)、軟骨細(xì)胞增殖和遷移能力較低等獨(dú)特的組織學(xué)特點(diǎn)，自我修復(fù)能力有限，易導(dǎo)致不可逆性損害和功能障礙。臨床上常用軟骨下骨板鉆孔或微骨折等技術(shù)，使髓腔內(nèi)未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)遷移到損傷部位，并通過(guò)增殖、分化形成類透明軟骨組織，盡管遠(yuǎn)期效果尚不理想

2、，但提示通過(guò)一定的方法，關(guān)節(jié)軟骨組織具有一定修復(fù)能力。因此提高BMSCs定向分化為軟骨細(xì)胞的能力，將有助于關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)。近期研究表明，低強(qiáng)度脈沖超聲(Low Intensity PulsedUltrasound，LIPU)能促進(jìn)骨折、骨不連的愈合以及促進(jìn)BMSCs向關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分化并分泌軟骨細(xì)胞外特有的細(xì)胞外基質(zhì).通過(guò)分子學(xué)及基因?qū)W研究提示，可能于LIPU的力學(xué)和熱學(xué)作用有關(guān)，而且不同培養(yǎng)環(huán)境和不同條件的LIPU作用后，得出的結(jié)論

3、亦不同。LIPU在關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù)作用及具體機(jī)制方面的研究尚不完善，距離有效的臨床應(yīng)用尚有一定距離。
　　 目的：
　　 1.體外分離、平面培養(yǎng)擴(kuò)增，獲得大量新西蘭兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；
　　 2.體外分離、平面培養(yǎng)擴(kuò)增，獲得大量新西蘭兔BMSCs；
　　 3.制備新型的脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)(Cell-Free Deminerized Bone Matrix，CFDBM)，并作為本實(shí)驗(yàn)組織工程軟骨的三維立體細(xì)胞

4、支架，探討其可行性；
　　 4.探討兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及BMSCs在CFDBM內(nèi)的增殖、分化及分泌細(xì)胞外基質(zhì)情況；
　　 5.通過(guò)給予實(shí)驗(yàn)組一定強(qiáng)度的LIPU刺激，探討LIPU對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及BMSCs的作用，為下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供參考，為L(zhǎng)IPU最終合理地應(yīng)用于治療關(guān)節(jié)軟骨損傷奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；
　　 方法：
　　 1.采用機(jī)械粉碎結(jié)合酶消化法獲取兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，通過(guò)體外平面培養(yǎng)擴(kuò)增、傳代，應(yīng)用細(xì)胞

5、形態(tài)學(xué)、Ⅱ型膠原免疫組化染色的方法，觀察細(xì)胞形態(tài)及鑒定細(xì)胞表型；
　　 2.采用全骨髓漂洗法和貼壁篩選法從兔骨髓組織中分離、純化BMSCs，進(jìn)行體外平面培養(yǎng)擴(kuò)增，應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫組化染色的方法，觀察細(xì)胞形態(tài)及鑒定細(xì)胞表型；
　　 3.新型的方法制備CFDBM，并采用CFDBM復(fù)合兔同種異體關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、及BMSCs構(gòu)建組織工程軟骨的三維共培養(yǎng)體系，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的增殖和基質(zhì)合成分泌情況，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、H-E染

6、色和Ⅱ型膠原免疫組化染色等方法，觀察CFDBM中細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化；
　　 4.構(gòu)建BMSCs-軟骨細(xì)胞-CFDBM三維共培養(yǎng)體系，予以頻率為1.0MHz、瞬時(shí)空間強(qiáng)度(SATA)為10mW/cm2、刺激時(shí)間為每天20min的LIPU刺激，應(yīng)用石蠟切片HE染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色等方法檢測(cè)細(xì)胞在CFDBM內(nèi)的形態(tài)、生長(zhǎng)增殖情況及Ⅱ型膠原合成和分泌情況；
　　 結(jié)果：
　　 1.第1-4代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及BMSC

7、s與原代細(xì)胞的生物學(xué)性狀相似；
　　 2.在CFDBM內(nèi)，軟骨細(xì)胞和BMSCs可以保持較高的增殖能力；第1-3代軟骨細(xì)胞維持其細(xì)胞表型穩(wěn)定；BMSCs與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)BMSCs向關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分化，并分泌軟骨細(xì)胞特有的細(xì)胞外基質(zhì)；
　　 3.BMSCs單獨(dú)種植于CFDBM內(nèi)，未見(jiàn)有軟骨細(xì)胞特有的細(xì)胞外基質(zhì)合成和分泌;
　　 4.關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞單獨(dú)種植于CFDBM內(nèi)，可見(jiàn)軟骨細(xì)胞特有的細(xì)胞外基質(zhì)合成和分泌逐

8、漸減少；
　　 5.BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞混合植于CFDBM內(nèi)，可見(jiàn)軟骨細(xì)胞特有的細(xì)胞外基質(zhì)合成和分泌，較單獨(dú)種植關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為多；
　　 6.頻率為1.0MHz、瞬時(shí)空間強(qiáng)度(SATA)為10mW/cm2、刺激時(shí)間為每天20min的LIPU刺激，不影響B(tài)MSCs活性；
　　 7.BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞混合植于CFDBM內(nèi)，并給予頻率為1.0MHz、瞬時(shí)空間強(qiáng)度(SATA)為10mW/cm2、刺激時(shí)間為每天2