Genistein對(duì)HeLa細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα和SIRT1的抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分genistein對(duì)HeLa細(xì)胞生長的抑制作用
　　 目的：本研究將檢測genistein對(duì)宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞生長的抑制作用，并測定其對(duì)HeLa細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度，同時(shí)檢測genistein對(duì)HeLa細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　 方法：先用MTT法測定不同濃度genistein對(duì)HeLa細(xì)胞作用24h和48h的吸光度值，計(jì)算不同濃度genistein對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率，并繪制抑制率曲線，確定IC50

2、值。然后以genisteinIC50作用后，Hoechst33258熒光染色檢測凋亡時(shí)細(xì)胞核形態(tài)變化，AnnexinV-FITC和PI標(biāo)記后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量檢測凋亡細(xì)胞比例，同時(shí)檢測細(xì)胞周期分布情況。
　　 結(jié)果：genistein可以抑制HeLa細(xì)胞生長，并具有劑量和時(shí)間依賴性，24h半數(shù)抑制濃度為126uM，48h半數(shù)抑制濃度為75uM。采用75uMgenistein作用48h后，Hoechst33258染色可見凋亡

3、細(xì)胞形態(tài)改變，且凋亡細(xì)胞比率較對(duì)照組增加；AnnexinV-FITC和PI標(biāo)記后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量檢測凋亡細(xì)胞，genistein作用組凋亡細(xì)胞比率明顯增加；細(xì)胞周期分析顯示genistein作用后G2/M細(xì)胞明顯增加，G0/G1期和S期細(xì)胞比例沒有明顯改變，提示genistein使HeLa細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。
　　 結(jié)論：genistein能夠抑制HeLa細(xì)胞增殖，且具有時(shí)間和劑量依賴性。以75uMgenistei

4、n作用48h，能夠引起細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期G2/M期阻滯。
　　 第二部分genistein對(duì)HeLa細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究
　　 目的：拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ，TopoⅡ）是普遍存在的細(xì)胞核酶，能夠解開S期和G2/M期緊湊纏繞的DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，催化DNA的超螺旋狀態(tài)與解旋狀態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)換，以便DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、重組、染色體分離等，使細(xì)胞生命活動(dòng)得以順利進(jìn)行。TopoⅡ有兩種

5、亞型，即TopoⅡα和TopoⅡβ，分子量分別為170kDaand180kDa.TopoⅡα和TopoⅡβ在細(xì)胞中具有不同的功能，TopoⅡα蛋白水平存在明顯細(xì)胞周期特異性，表現(xiàn)為G1期較低，S期開始升高，G2/M期達(dá)頂峰。臨床研究表明，在如肺癌、乳腺癌及頭頸部腫瘤組織內(nèi)，TopoⅡα基因表達(dá)明顯高于正常組織，因此TopoⅡα被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞增殖的一個(gè)特異性標(biāo)志，在惡性腫瘤的發(fā)生、診斷，以及治療中具有重要作用。
　　 本研究旨在

6、研究genistein對(duì)TopoⅡα基因表達(dá)的影響，并探討轉(zhuǎn)錄因子Sp1和Sp3是否參與genistein對(duì)TopoⅡα的表達(dá)調(diào)控。
　　 方法：RT-PCR檢測genistein作用后TopoⅡα及其上游轉(zhuǎn)錄因子Sp1、sp3mRNA表達(dá)改變，western-blotting的方法檢測TopoⅡα及轉(zhuǎn)錄因子Sp1、Sp3蛋白表達(dá)變化。TopoⅡα的啟動(dòng)子區(qū)存在2個(gè)GC盒，其中一個(gè)靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，另一個(gè)遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，為測定

7、兩個(gè)GC盒中哪個(gè)在TopoⅡα表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用，針對(duì)兩個(gè)GC盒，分別跨越GC序列設(shè)計(jì)兩對(duì)擴(kuò)增引物，用染色體免疫共沉淀的方法檢測TopoⅡα表達(dá)改變是否與轉(zhuǎn)錄因子Sp1、Sp3相關(guān)，并確定Sp1和Sp3分別通過哪個(gè)GC盒發(fā)揮作用。
　　 結(jié)果：genistein作用后，TopoⅡα與Sp1mRNA及蛋白表達(dá)降低，而Sp3mRNA和蛋白表達(dá)增加，且TopoⅡα表達(dá)變化與表達(dá)改變有關(guān)，兩個(gè)GC盒在Sp1和Sp3參與genistein

8、對(duì)TopoⅡα表達(dá)調(diào)控中都發(fā)揮作用。
　　 結(jié)論：genistein能夠降低TopoⅡαmRNA及蛋白表達(dá)，降低Sp1mRNA及蛋白表達(dá)，增加Sp3表達(dá)；且TopoⅡα表達(dá)變化與Sp1、Sp3表達(dá)改變有關(guān)；兩個(gè)GC盒在Sp1和Sp3參與genistein對(duì)TopoⅡα表達(dá)調(diào)控中都發(fā)揮作用。
　　 第三部分genistein對(duì)HeLa細(xì)胞SIRT1的抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究目的：蛋白質(zhì)賴氨酸側(cè)鏈能夠被乙?；?、甲基化、泛素化，

9、及ADP核糖基化，這些競爭性、可逆性翻譯后修飾由不同的酶及與其相互作用的一些復(fù)合體調(diào)節(jié)。在真核細(xì)胞，乙?；亲钇毡榈墓矁r(jià)修飾，且目前認(rèn)為乙?；攘姿峄懈鼜V泛的底物?，F(xiàn)已知的有數(shù)百種的蛋白都被乙?；揎?，乙?；軌蛎黠@改變蛋白的特性和功能，mRNA剪接、運(yùn)輸、整體性、翻譯、蛋白活性、定位、穩(wěn)定性和相互作用都受乙酰化調(diào)節(jié)，因此乙酰化能夠影響從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到轉(zhuǎn)錄到蛋白降解調(diào)節(jié)過程的每一步，可逆的賴氨酸基團(tuán)乙?；瘜?duì)蛋白功能和細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要

10、。調(diào)節(jié)蛋白乙?；癄顟B(tài)的酶，包括乙?；负兔撘阴；浮Ｏ鄬?duì)于乙?；福鳛樗幬锇悬c(diǎn)，脫乙?；甘艿窖芯空叩母嚓P(guān)注。至今研究表明，脫乙?；敢种苿┰诟鞣N疾病中的應(yīng)用更有希望，如白血病和其他的血液系統(tǒng)疾病。脫乙?；阜譃槿悾?、二類屬于經(jīng)典的脫乙?；福呋磻?yīng)需要Zn離子作為輔因子，sirtuins蛋白屬于第三類，與經(jīng)典的脫乙?；缸饔糜兴煌?，它的催化作用不需要鋅指的參與，而是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadenin

11、edinucleotide，NAD）依賴性的，因而新陳代謝則可調(diào)節(jié)其活性，這也使其剛剛問世便成為了眾多科學(xué)研究的對(duì)象。
　　 沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Silentinformationregulator2，Sir2）是由Sinclair和同事在麻省理工學(xué)院的LeonardGuarente實(shí)驗(yàn)室于酵母中發(fā)現(xiàn)的，它是一種NAD依賴的組蛋白脫乙?；浮＝湍窼ir2與染色體末端的失活及rDNA的轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)。酵母Sir2含量加倍，可以延緩復(fù)

12、制衰老，延長壽命。Sir2是一個(gè)高度保守的基因家族。Sir2相關(guān)酶類（sirtuins，SIRT）是Sir2的同源物，它不僅存在于酵母、果蠅、秀麗桿菌等細(xì)胞內(nèi)，還廣泛存在于哺乳動(dòng)物各種細(xì)胞內(nèi)。caloricrestriction（CR）試驗(yàn)表明，在酵母、秀麗桿菌、蠕蟲、小鼠及人均可以通過增加SIRTI的活性而延長壽命，因而SIRT被認(rèn)為是一個(gè)長壽基因。至今為止，人類細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7種不同類型的SIRT蛋白，分別命名為SIRT1-SIR

13、T7。SIRT1是目前研究最多最清楚的一個(gè)成員，研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物SIRT1與宿主一些已知與癌癥有關(guān)的因子相互作用，可能在一些情況下促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存，而目前尚缺乏關(guān)于genistein對(duì)腫瘤細(xì)胞中SIRT1的作用的研究報(bào)道。因此，本研究就genistein對(duì)HeLa細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響及其作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 方法：HeLa細(xì)胞經(jīng)SIRT1選擇性抑制劑splitocimin預(yù)處理后，用不同濃度genistein作用，M

14、TT法測定不同濃度genistein對(duì)HeLa細(xì)胞作用，比較與非經(jīng)抑制劑處理組之間細(xì)胞細(xì)胞生長抑制情況；Hoechst33258熒光染色檢測細(xì)胞凋亡情況的差別；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布情況。并比較splitocimin預(yù)處理對(duì)genistein在細(xì)胞周期G2/M期阻滯作用中的影響；應(yīng)用Westernblot印跡檢測genistein對(duì)細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)水平的變化及經(jīng)splitocimin預(yù)處理后genistein對(duì)SIRT1蛋白

15、表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：splitocimin預(yù)處理后，genistein對(duì)HeLa細(xì)胞生長抑制作用增強(qiáng)；Hoechst33258染色可見凋亡細(xì)胞形態(tài)改變，單純splitocimin處理組與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率沒有明顯區(qū)別。但經(jīng)splitocimin預(yù)處理后，genistein的促凋亡作用比未經(jīng)splitocimin預(yù)處理的單純genistein作用時(shí)細(xì)胞凋亡率增加。細(xì)胞周期分析顯示，單純splitocimin的作用可以使S期細(xì)胞

16、增加，經(jīng)splitocimin預(yù)處理后再經(jīng)genistein作用，S期細(xì)胞數(shù)減少，而G2/M期阻滯增加。genistein可以抑制HeLa細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性；經(jīng)splitocimin預(yù)處理后，再經(jīng)genistein作用時(shí)，SIRT1蛋白的表達(dá)較只用splitocimin預(yù)處理時(shí)有所增加，但仍低于對(duì)照組水平。
　　 結(jié)論：genistein可通過下調(diào)SIRT1表達(dá)而抑制HeLa細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SI