Genistein對HeLa細胞拓撲異構(gòu)酶Ⅱα和SIRT1的抑制作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、第一部分genistein對HeLa細胞生長的抑制作用
　　 目的：本研究將檢測genistein對宮頸癌細胞株HeLa細胞生長的抑制作用，并測定其對HeLa細胞的半數(shù)抑制濃度，同時檢測genistein對HeLa細胞細胞周期及凋亡的影響。
　　 方法：先用MTT法測定不同濃度genistein對HeLa細胞作用24h和48h的吸光度值，計算不同濃度genistein對HeLa細胞的抑制率，并繪制抑制率曲線，確定IC50

2、值。然后以genisteinIC50作用后，Hoechst33258熒光染色檢測凋亡時細胞核形態(tài)變化，AnnexinV-FITC和PI標記后采用流式細胞術(shù)進一步定量檢測凋亡細胞比例，同時檢測細胞周期分布情況。
　　 結(jié)果：genistein可以抑制HeLa細胞生長，并具有劑量和時間依賴性，24h半數(shù)抑制濃度為126uM，48h半數(shù)抑制濃度為75uM。采用75uMgenistein作用48h后，Hoechst33258染色可見凋亡

3、細胞形態(tài)改變，且凋亡細胞比率較對照組增加；AnnexinV-FITC和PI標記后采用流式細胞術(shù)進一步定量檢測凋亡細胞，genistein作用組凋亡細胞比率明顯增加；細胞周期分析顯示genistein作用后G2/M細胞明顯增加，G0/G1期和S期細胞比例沒有明顯改變，提示genistein使HeLa細胞周期阻滯于G2/M期。
　　 結(jié)論：genistein能夠抑制HeLa細胞增殖，且具有時間和劑量依賴性。以75uMgenistei

4、n作用48h，能夠引起細胞凋亡及細胞周期G2/M期阻滯。
　　 第二部分genistein對HeLa細胞拓撲異構(gòu)酶Ⅱα抑制作用及相關(guān)機制研究
　　 目的：拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ，TopoⅡ）是普遍存在的細胞核酶，能夠解開S期和G2/M期緊湊纏繞的DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，催化DNA的超螺旋狀態(tài)與解旋狀態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)換，以便DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、重組、染色體分離等，使細胞生命活動得以順利進行。TopoⅡ有兩種

5、亞型，即TopoⅡα和TopoⅡβ，分子量分別為170kDaand180kDa.TopoⅡα和TopoⅡβ在細胞中具有不同的功能，TopoⅡα蛋白水平存在明顯細胞周期特異性，表現(xiàn)為G1期較低，S期開始升高，G2/M期達頂峰。臨床研究表明，在如肺癌、乳腺癌及頭頸部腫瘤組織內(nèi)，TopoⅡα基因表達明顯高于正常組織，因此TopoⅡα被認為是腫瘤細胞增殖的一個特異性標志，在惡性腫瘤的發(fā)生、診斷，以及治療中具有重要作用。
　　 本研究旨在

6、研究genistein對TopoⅡα基因表達的影響，并探討轉(zhuǎn)錄因子Sp1和Sp3是否參與genistein對TopoⅡα的表達調(diào)控。
　　 方法：RT-PCR檢測genistein作用后TopoⅡα及其上游轉(zhuǎn)錄因子Sp1、sp3mRNA表達改變，western-blotting的方法檢測TopoⅡα及轉(zhuǎn)錄因子Sp1、Sp3蛋白表達變化。TopoⅡα的啟動子區(qū)存在2個GC盒，其中一個靠近轉(zhuǎn)錄起始位點，另一個遠離轉(zhuǎn)錄起始位點，為測定

7、兩個GC盒中哪個在TopoⅡα表達調(diào)控中發(fā)揮作用，針對兩個GC盒，分別跨越GC序列設(shè)計兩對擴增引物，用染色體免疫共沉淀的方法檢測TopoⅡα表達改變是否與轉(zhuǎn)錄因子Sp1、Sp3相關(guān)，并確定Sp1和Sp3分別通過哪個GC盒發(fā)揮作用。
　　 結(jié)果：genistein作用后，TopoⅡα與Sp1mRNA及蛋白表達降低，而Sp3mRNA和蛋白表達增加，且TopoⅡα表達變化與表達改變有關(guān)，兩個GC盒在Sp1和Sp3參與genistein

8、對TopoⅡα表達調(diào)控中都發(fā)揮作用。
　　 結(jié)論：genistein能夠降低TopoⅡαmRNA及蛋白表達，降低Sp1mRNA及蛋白表達，增加Sp3表達；且TopoⅡα表達變化與Sp1、Sp3表達改變有關(guān)；兩個GC盒在Sp1和Sp3參與genistein對TopoⅡα表達調(diào)控中都發(fā)揮作用。
　　 第三部分genistein對HeLa細胞SIRT1的抑制作用及相關(guān)機制研究目的：蛋白質(zhì)賴氨酸側(cè)鏈能夠被乙?；⒓谆?、泛素化，

9、及ADP核糖基化，這些競爭性、可逆性翻譯后修飾由不同的酶及與其相互作用的一些復(fù)合體調(diào)節(jié)。在真核細胞，乙?；亲钇毡榈墓矁r修飾，且目前認為乙?；攘姿峄懈鼜V泛的底物?，F(xiàn)已知的有數(shù)百種的蛋白都被乙?；揎?，乙?；軌蛎黠@改變蛋白的特性和功能，mRNA剪接、運輸、整體性、翻譯、蛋白活性、定位、穩(wěn)定性和相互作用都受乙?；{(diào)節(jié)，因此乙?；軌蛴绊憦男盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)到轉(zhuǎn)錄到蛋白降解調(diào)節(jié)過程的每一步，可逆的賴氨酸基團乙?；瘜Φ鞍坠δ芎图毎W(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要

10、。調(diào)節(jié)蛋白乙?；癄顟B(tài)的酶，包括乙?；负兔撘阴；?。相對于乙?；?，作為藥物靶點，脫乙?；甘艿窖芯空叩母嚓P(guān)注。至今研究表明，脫乙酰化酶抑制劑在各種疾病中的應(yīng)用更有希望，如白血病和其他的血液系統(tǒng)疾病。脫乙?；阜譃槿?，一、二類屬于經(jīng)典的脫乙?；?，催化反應(yīng)需要Zn離子作為輔因子，sirtuins蛋白屬于第三類，與經(jīng)典的脫乙?；缸饔糜兴煌?，它的催化作用不需要鋅指的參與，而是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadenin

11、edinucleotide，NAD）依賴性的，因而新陳代謝則可調(diào)節(jié)其活性，這也使其剛剛問世便成為了眾多科學(xué)研究的對象。
　　 沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Silentinformationregulator2，Sir2）是由Sinclair和同事在麻省理工學(xué)院的LeonardGuarente實驗室于酵母中發(fā)現(xiàn)的，它是一種NAD依賴的組蛋白脫乙酰化酶。酵母Sir2與染色體末端的失活及rDNA的轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)。酵母Sir2含量加倍，可以延緩復(fù)

12、制衰老，延長壽命。Sir2是一個高度保守的基因家族。Sir2相關(guān)酶類（sirtuins，SIRT）是Sir2的同源物，它不僅存在于酵母、果蠅、秀麗桿菌等細胞內(nèi)，還廣泛存在于哺乳動物各種細胞內(nèi)。caloricrestriction（CR）試驗表明，在酵母、秀麗桿菌、蠕蟲、小鼠及人均可以通過增加SIRTI的活性而延長壽命，因而SIRT被認為是一個長壽基因。至今為止，人類細胞內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7種不同類型的SIRT蛋白，分別命名為SIRT1-SIR

13、T7。SIRT1是目前研究最多最清楚的一個成員，研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物SIRT1與宿主一些已知與癌癥有關(guān)的因子相互作用，可能在一些情況下促進腫瘤細胞的生存，而目前尚缺乏關(guān)于genistein對腫瘤細胞中SIRT1的作用的研究報道。因此，本研究就genistein對HeLa細胞SIRT1表達的影響及其作用機制進行探討。
　　 方法：HeLa細胞經(jīng)SIRT1選擇性抑制劑splitocimin預(yù)處理后，用不同濃度genistein作用，M

14、TT法測定不同濃度genistein對HeLa細胞作用，比較與非經(jīng)抑制劑處理組之間細胞細胞生長抑制情況；Hoechst33258熒光染色檢測細胞凋亡情況的差別；流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布情況。并比較splitocimin預(yù)處理對genistein在細胞周期G2/M期阻滯作用中的影響；應(yīng)用Westernblot印跡檢測genistein對細胞內(nèi)SIRT1蛋白表達水平的變化及經(jīng)splitocimin預(yù)處理后genistein對SIRT1蛋白

15、表達的影響。
　　 結(jié)果：splitocimin預(yù)處理后，genistein對HeLa細胞生長抑制作用增強；Hoechst33258染色可見凋亡細胞形態(tài)改變，單純splitocimin處理組與對照組細胞凋亡率沒有明顯區(qū)別。但經(jīng)splitocimin預(yù)處理后，genistein的促凋亡作用比未經(jīng)splitocimin預(yù)處理的單純genistein作用時細胞凋亡率增加。細胞周期分析顯示，單純splitocimin的作用可以使S期細胞

16、增加，經(jīng)splitocimin預(yù)處理后再經(jīng)genistein作用，S期細胞數(shù)減少，而G2/M期阻滯增加。genistein可以抑制HeLa細胞內(nèi)SIRT1蛋白的表達，且呈劑量依賴性；經(jīng)splitocimin預(yù)處理后，再經(jīng)genistein作用時，SIRT1蛋白的表達較只用splitocimin預(yù)處理時有所增加，但仍低于對照組水平。
　　 結(jié)論：genistein可通過下調(diào)SIRT1表達而抑制HeLa細胞的生長，誘導(dǎo)細胞凋亡。SI