轉(zhuǎn)基因bkt和CrtR-B啟動(dòng)草莓生物合成蝦青素的研究.pdf

1、蝦青素（astaxanthin）是一種氧化性酮式類胡蘿卜素，最新的生理學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，它具有很強(qiáng)的生物抗氧化活性，被稱為“超級(jí)維生素E”。蝦青素可以解除光誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化脅迫，有很強(qiáng)的抑制光敏作用的能力，可以提高生物體光能的利用率，提高作物的產(chǎn)量；此外蝦青素還具有促進(jìn)抗體產(chǎn)生、抗紫外線輻射、增強(qiáng)免疫力、抗癌癥以及防止皮膚衰老、維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼睛健康等多種生理功能。草莓（Fragaria×ananassa Duch.)，享有“水果皇

2、后”之美譽(yù)，是一種薔薇科草莓屬多年生草本植物。草莓是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的水果，它的世界產(chǎn)量居小漿果之首，其果實(shí)柔軟多汁，富含極豐富的糖、酸、礦物質(zhì)、維生素C和蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等。如果能在草莓中合成蝦青素，則可能在一定程度上增強(qiáng)植株各組織的抗光氧化能力，提高生物體光能利用率，提高作物產(chǎn)量，改善草莓的品質(zhì)，對(duì)進(jìn)一步提高草莓的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有重要的意義。
　　β-胡蘿卜素酮化酶(BKT)和β-胡蘿卜素羥化酶(CrtR-B)是蝦青素合成過(guò)程中的關(guān)鍵

3、酶，本研究將 bkt和CrtR- B這兩個(gè)基因構(gòu)建到同一植物表達(dá)載體上，以獲得pCAMBIA1301-bkt-CrtR-B雙價(jià)植物表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105,由其介導(dǎo)轉(zhuǎn)化草莓品種‘甜查理’（‘Sweet Charlie’）,以獲得轉(zhuǎn)基因植株,有望通過(guò)調(diào)控代謝途徑在草莓中合成蝦青素。具體研究結(jié)果如下：
　　1.建立了草莓品種“豐香”（‘Toyonoka’）、“章姬”（‘Tochiotome’）、“甜查理”（‘Sweet

4、Charlie’）和“紅顏”（‘Benihoppe’）的組培快繁體系。結(jié)果表明：不同基因型草莓品種的組培快繁體系存在差異。不同品種的草莓品種最佳的增值培養(yǎng)基不同，甜查理的最佳增值培養(yǎng)基為MS+6-BA0.3 mg/L+NAA0.5 mg/L；章姬的最佳的增值培養(yǎng)基為MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.1 mg/L；紅顏的最佳的增值培養(yǎng)基為 MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.1 mg/L；豐香的最佳的增值培養(yǎng)基為MS+6-B

5、A0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L。不同基因型的草莓生根所需要的激素濃度不同，對(duì)于章姬和豐香品種，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA0.5 mg/L；紅顏為1/2 MS+IBA0.8 mg/L；甜查理的最適生根組合為1/2 MS+IBA0.1 mg/L。
　　2.研究了影響遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素，激素的種類和濃度、抗生素篩選等對(duì)草莓品種“甜查理”（‘Sweet Charlie’）和“紅顏”（‘Benihoppe’）葉片再生的

6、影響，同時(shí)研究了抗生素潮霉素（Hm）及頭孢霉素（Cef）對(duì)組培苗增值和生根的影響，為后面工程菌介導(dǎo)的草莓遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明:無(wú)論對(duì)于紅顏或是甜查理，TDZ的濃度組合比6-BA的濃度組合更有利于葉片的離體再生。對(duì)于紅顏葉片再生，最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為MS+TDZ2.0 mg/L+IAA0.1 mg/L，甜查理的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為MS+TDZ3.0 mg/L+IBA0.1 mg/L。對(duì)于紅顏和甜查理這兩個(gè)品種，葉片再生和繼代苗的選擇

7、上宜選用潮霉素的濃度為4 mg/L作為選擇壓，而在生根上用潮霉素3 mg/L作為選擇壓。在葉再生時(shí)可以將頭孢霉素為400 mg/L作為抑菌濃度，在繼代苗生根過(guò)程中可以將頭孢霉素為200 mg/L作為抑菌濃度。
　　3.構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-bkt-crtR-B。用bkt基因替換PBI121中的GUS基因形成含有CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子的bkt基因表達(dá)盒，然后將表達(dá)盒插入植物表達(dá)載體 pCAMBIA13

8、01中獲得植物表達(dá)載體 p1301-bkt；再用crtR-B基因替換p1301-bkt中的GUS基因，獲得植物雙價(jià)表達(dá)載體pCAMBIA1301-bkt-crtR-B。并將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，獲得工程菌EHA105/pCAMBIA1301-bkt-crtR-B。
　　4.以草莓品種“甜查理”（‘Sweet Charlie’）組培苗葉片為受體，用工程菌EHA105/pCAMBIA1301-bkt-crtR-B介導(dǎo)進(jìn)行草