山東省雞腎型IBV的分離鑒定及其核蛋白基因的遺傳變異分析.pdf

1、本研究在2006-2007年從山東省分離到10株腎型IBV，并通過電鏡形態(tài)觀察、致雞胚矮小化試驗、病毒干擾試驗、血凝試驗、動物回歸試驗以及分子生物學(xué)試驗等方法對其進行了鑒定，同時對病毒基因組中的核蛋白基因序列進行了測定、分析和比較，以說明山東省腎型IBV毒株之間以及與參考毒株之間基因的遺傳變異情況，同時構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析山東省腎型IBV分離株與參考株之間的系統(tǒng)進化關(guān)系，探討山東省腎型IB流行的背景和原因。 現(xiàn)地瀕死病雞病變組織

2、處理后接種9～11日齡SPF雞胚，接種雞胚后72h內(nèi)收集尿囊液，同時觀察胚體病變。傳3～7代后，發(fā)現(xiàn)死亡雞胚表現(xiàn)出生長發(fā)育障礙(侏儒胚)，胚體彌漫性出血，尤其是頭部出血比較明顯，未死亡雞胚呈現(xiàn)典型的卷曲胚。病毒尿囊液對雞外周血紅細(xì)胞無凝集活性。病毒尿囊液在電鏡下表現(xiàn)為病毒粒子大多呈球形，直徑約為80～120nm，有囊膜，表面有松散、均勻排列的冠狀突起，呈現(xiàn)典型的冠狀病毒特征，而且未發(fā)現(xiàn)有其它病毒粒子的存在。病毒干擾試驗可見其能明顯干擾N

3、DV在雞胚中的增殖。未經(jīng)任何處理的10株分離株病毒對10mL/L的雞紅細(xì)胞無血凝活性，而經(jīng)Ⅰ型磷脂酶C處理后10株分離株病毒對雞紅細(xì)胞具有血凝活性。從10株分離病毒的SPF雞胚尿囊液中提取病毒RNA，經(jīng)RT-PCR擴增后將產(chǎn)物電泳，均獲得了1600bp左右的核酸片段，與當(dāng)初設(shè)計引物所要擴增的IBV基因片段大小一致，所以可以斷定本研究所分離的病毒為雞傳染性支氣管炎病毒?；貧w動物后，均表現(xiàn)為腎腫脹、有尿酸鹽沉積，形成“花斑腎”，因而確認(rèn)從山

4、東省分離到的這10株病毒為腎型IBV。 應(yīng)用RT-PCR方法對從山東省分離鑒定到2006-2007年間的10株腎型IBV核蛋白基因序列進行了克隆、測定及分析，結(jié)果表明，這些毒株核蛋白基因的核苷酸序列由1230bp組成，編碼由409個氨基酸殘基組成的多肽，與Beaudette株相應(yīng)區(qū)域基因序列長度一致。10株腎型IBV分離毒株之間相比，N基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸的同源性分別為84.6％～99.7％和86.6％～99.8％，與參考毒株

5、N基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸的同源性分別為84.1％～98.9％和86.1％～98.5％。進行序列比較后發(fā)現(xiàn)，山東省大部分腎型IBV分離株的核蛋白基因的核苷酸序列存在廣泛的基因突變現(xiàn)象，這可能是造成山東省腎型IBV分離株基因組發(fā)生變異的主要原因之一。 根據(jù)本研究從山東省分離鑒定到2006-2007年間的10株腎型IBV病毒與我國其他IBV分離株、我國常用疫苗株以及國外參考毒株繪制的系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，從山東省分離到10株腎型IBV具有兩

6、個大的基因進化群。SD0605和SD0608屬于基因Ⅰ型，其中主要是Mass血清型毒株，包括美國、荷蘭、澳大利亞、日本等國家的IBV代表性毒株以及國內(nèi)的。腎型IBV代表毒株。SD0605N基因與中國廣東IBV腎型疫苗株D41以及H120同源性最高，核苷酸及推導(dǎo)氨基酸同源性均分別為98.9％和98.5％；SD0608N基因與中國廣西腎型毒株GX2的同源性最高，核苷酸及推導(dǎo)氨基酸同源性分別為94.9％和95.6％。這提示SD0605和SD0

7、608的存在可能與山東省長期使用弱毒疫苗有關(guān)，存在基因重組現(xiàn)象。其余的八株分離株病毒屬于基因Ⅱ型，其中主要是廣東腎型IBV毒株GDS14和新疆腎型IBV毒株LX4，以及山東的IBV分離株QXIBV，與我國常用弱毒疫苗株如H120、H52等關(guān)系較遠。以上結(jié)果說明山東省腎型IBV毒株與我國其他地方的腎型IBV毒株關(guān)系比較近，現(xiàn)有的疫苗可以對部分毒株起到一定的預(yù)防作用，但對于SD0702這種變異如此大的毒株可能很難有效預(yù)防，有必要繼續(xù)跟蹤研究