山東省家兔皮膚真菌病病原ITS序列測定及遺傳變異分析.pdf

1、皮膚真菌病是人畜共患接觸性皮膚傳染病，又稱脫毛癬，對人和動(dòng)物健康形成極大的威脅。皮膚真菌包括三個(gè)屬，即毛癬菌屬（、小孢子菌屬（和表皮癬菌屬（它們可以侵犯皮膚、毛發(fā)和指（趾）甲，寄生或腐生于表皮角質(zhì)、毛發(fā)和甲板的角蛋白組織中，引起淺部真菌病。引起家兔皮膚真菌病的病原菌主要是須毛癬菌（石膏樣小孢子菌（犬小孢子菌（。不論是從家兔皮膚病灶處或從非病灶處分離到這三種菌均視為異常，因?yàn)榉遣≡钐幍恼婢芸赡茈S后引起皮膚病，同時(shí)造成飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)人員的感染

2、。
　　 山東為養(yǎng)兔大省，家兔皮膚真菌病已對養(yǎng)兔業(yè)造成很大損失。目前對皮膚病原真菌檢測主要是依靠真菌培養(yǎng)物的菌落形態(tài)及真菌菌絲的顯微鏡觀察。鏡檢雖然快速，但需要有多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，并很難鑒別到種。實(shí)際上，真菌的表型特征很容易受到外界因素的影響，例如溫度變化，培養(yǎng)基成份和化學(xué)治療，這些都影響真菌代謝過程，從而影響結(jié)果的觀察。而且要想得到典型的真菌菌落形態(tài)和鏡下特征一般需要2～3周的培養(yǎng)時(shí)間，對一些缺少特異的形態(tài)及鏡下特征的菌種還需要

3、進(jìn)行特殊培養(yǎng)基的第二次培養(yǎng)。因而，建立皮膚真菌病的快速診斷方法、分離獲得山東省兔場皮膚真菌致病菌株、探明其變異現(xiàn)狀及耐藥性，對有的放矢防治該病具有重要意義。本試驗(yàn)在比較了分子生物學(xué)方法和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測方法分離鑒定皮膚真菌病原優(yōu)劣的基礎(chǔ)上，分離獲得了山東流行菌株，并通過對皮膚真菌的ITS 區(qū)基因進(jìn)行克隆、測序，探討了分離株的變異及遺傳進(jìn)化關(guān)系，然后對分離株進(jìn)行了耐藥性檢測，獲得了令人滿意的結(jié)果。本研究分以下三部分內(nèi)容：
　　 首先

4、，根據(jù)皮膚真菌特異性rDNA序列設(shè)計(jì)通用引物，對已知菌株及其他微生物進(jìn)行PCR 檢測并克隆測序，驗(yàn)證PCR 方法對鑒定皮膚真菌病原的特異性、靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果顯示，檢測的已知菌株可在650bp-770bp之間擴(kuò)增出特異片段，但其它微生物、兔體細(xì)胞和健康種兔樣品均未擴(kuò)增出類似片段。另外，將PCR 方法與常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定方法比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢出率前者高于后者（分別為82.8％和60.55％）。然后采用以上兩種方法從山東省主要兔場分離鑒定出9

5、 株兔源性皮膚真菌，其中須癬毛癬菌6 株，石膏樣小孢子菌2 株，犬小孢子菌1 株。其次，利用皮膚真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)保守序列設(shè)計(jì)通用引物，對采自山東地區(qū)主要兔場的16 株皮膚真菌分離菌進(jìn)行了ITS 區(qū)的克隆、測序，探討了序列變異及遺傳進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果顯示，不同病原菌的5.8 SrDNA序列高度保守，而ITS 區(qū)的變異性較高；
　　 對該區(qū)序列的聚類分析表明，不同種菌株ITS1 比ITS2 在堿基構(gòu)成上和序列長度有更大變異；而種內(nèi)各菌株

6、的ITS1和ITS2 在長度上均沒有變異，堿基構(gòu)成上存在微小的變異，可基于該區(qū)進(jìn)行兔皮膚真菌的分類鑒定。該研究確定了兔皮膚病原PCR 檢測特異引物的靶序列，為兔皮膚真菌病病原的特異性分子鑒定提供了可靠的靶標(biāo)，也為兔皮膚真菌的科學(xué)分類提供了分子依據(jù)。同時(shí)，通過對分離株ITS 區(qū)的克隆、測序及分析，得出與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類不一致的結(jié)果。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類認(rèn)為：石膏樣小孢子菌和犬小孢子菌同屬小孢菌屬，須癬毛癬菌和紅色毛癬菌等均屬于毛癬菌屬；但本實(shí)

7、驗(yàn)的序列分析結(jié)果顯示：石膏樣小孢子菌與須癬毛癬菌的同源性較犬小孢子菌高。
　　 最后，采用ATB FUNGUS 3 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分析引起山東省家兔皮膚真菌病病原的耐藥性，結(jié)果顯示，分離的皮膚真菌病原菌均對兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、伏立康唑和伊曲康唑敏感，分別為83.33％、68.75％、75％和64.41％，而對氟康唑具有耐藥性，僅20.83％敏感。其中犬小孢子菌對兩性霉素B 最為敏感（87.5％），須癬毛癬菌和石膏樣小孢子菌