Shewanella piezotolerans WP3深海環(huán)境適應性研究——厭氧呼吸系統(tǒng)對不同環(huán)境因子與調控因子的響應.pdf

1、本課題以深海細菌Shewanella piezotoleransWP3作為研究對象，以WP3的厭氧呼吸系統(tǒng)作為切入點，通過研究厭氧呼吸系統(tǒng)對不同深海環(huán)境因子（高靜水壓，氧化還原環(huán)境的變化和鐵濃度等）的響應以及全局調控因子（鐵穩(wěn)態(tài)調控蛋白和small RNA伴侶蛋白）對厭氧呼吸系統(tǒng)的影響，揭示W(wǎng)P3的厭氧呼吸系統(tǒng)對深海環(huán)境適應性的重要作用。
　　首先，通過對金屬底物厭氧呼吸系統(tǒng)基因簇（mtr-omc cluster）各個基因突變菌株

2、在大氣壓和高靜水壓條件下不溶性鐵還原能力的測定，發(fā)現(xiàn)高靜水壓對不溶性鐵呼吸系統(tǒng)具有一定的選擇作用。該基因簇中的MtrABC電子傳遞與末端還原酶系統(tǒng)在高靜水壓條件下具有更為顯著的功能，而兩個在常壓下發(fā)揮作用的OmcA-like蛋白（外膜細胞色素c蛋白）的功能在高靜水壓條件下受到抑制。同時通過比較WP3在以高氧化還原電勢的氧氣和較低氧化還原電勢的延胡索酸作為電子受體時的轉錄組差異，發(fā)現(xiàn)WP3能夠通過調控不同的厭氧呼吸電子傳遞鏈系統(tǒng)，能量產(chǎn)生

3、系統(tǒng)，與厭氧呼吸輔因子有關的轉運系統(tǒng)和電子受體趨化系統(tǒng)來適應深海劇烈變化的氧化還原環(huán)境。
　　其次，通過鐵調控蛋白Fur的缺失菌株對不同深海環(huán)境因子的響應，發(fā)現(xiàn)Fur蛋白對WP3缺鐵環(huán)境的適應性和厭氧呼吸能力有顯著影響。轉錄組學分析表明Fur蛋白在深海細菌WP3中擴大了它原有的調控網(wǎng)絡，將編碼厭氧呼吸電子傳遞鏈系統(tǒng)，Heme合成系統(tǒng)以及細胞色素c成熟系統(tǒng)的基因一并納入，通過直接或者間接調控的方式來激活不同的厭氧呼吸過程。生物信息學

4、分析與和凝膠阻滯實驗證實了Fur蛋白能夠直接與omcA，napD等厭氧呼吸電子傳遞鏈系統(tǒng)中相關基因啟動子區(qū)域的Fur box結合，正向調控這些基因的表達；同時也發(fā)現(xiàn)了Fur蛋白能夠通過調控Crp-like蛋白，ArcA/B雙組分蛋白等重要的厭氧呼吸調控因子和small RNA_RyhB間接地調控厭氧呼吸系統(tǒng)。這種把鐵穩(wěn)態(tài)和厭氧呼吸的調控結合起來的方式可能是WP3適應深海環(huán)境的一種策略。另外，F(xiàn)ur蛋白能夠對WP3的生物礦化過程能夠產(chǎn)生一

5、定的影響，但這種影響只停留在減慢了磁鐵礦的形成這個有限的層面上，并沒有更進一步地影響形成礦物的礦質學性質。
　　第三，通過small RNA伴侶蛋白Hfq的缺失菌株對不同深海環(huán)境因子的響應，發(fā)現(xiàn)Hfq蛋白對WP3的厭氧呼吸能力有顯著影響。轉錄組和蛋白組學分析表明Hfq蛋白在深海細菌WP3中對厭氧呼吸的調控網(wǎng)絡較為復雜且不同于其他細菌：Hfq蛋白激活了WP3在厭氧條件下重要的產(chǎn)能過程（底物水平磷酸化）和中間代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生途徑（乙醛酸

6、循環(huán)途徑），激活了厭氧呼吸調控因子Crp蛋白、不同厭氧呼吸系統(tǒng)中關鍵的電子傳遞與末端還原酶以及末端還原酶重要的輔因子鉬的轉運和生物合成。Hfq蛋白作為一個多效的調控因子，還能夠在細胞的運動性、氨基酸代謝、鐵穩(wěn)態(tài)調控、信號傳導途徑以及sigma因子表達等方面影響WP3的深海環(huán)境適應性。
　　最后，我們構建了一個以WP3菌株體內自然噬菌體SW1為基礎的表達質粒pSW2，該質粒能夠在E. coli和不同的Shewanella菌株中自由穿