深海細菌Shewanella piezotolerans WP3細胞色素c相關基因的克隆表達和功能鑒定.pdf

1、深海是一個特殊的生態(tài)環(huán)境，這里永久高壓、低溫、黑暗、高鹽和寡營養(yǎng)。生活在這些環(huán)境下的極端微生物必然有特殊的生理代謝途徑來適應極端環(huán)境。對深海微生物的研究不僅有助于了解生命的起源，而且可以了解各種極端微生物的生活特性，為深海微生物資源的開發(fā)利用奠定基礎。
　　2003年本實驗室在西太平洋暖池區(qū)1914米的沉積物中分離到一株具有異化金屬還原能力的耐壓低溫細菌，菌種鑒定為希瓦氏屬新種，命名為 Shewanella piezotolera

2、ns WP3（以下簡稱 WP3）。WP3全基因組測序已經完成，并對其環(huán)境適應性機制做了功能基因組學分析。WP3擁有眾多的基因和基因簇來幫助它適應極端環(huán)境。特別的是，WP3中包含55個編碼細胞色素c的開放讀碼框（ORFs），是目前已測序Shewanella屬菌株中最多的。
　　通過對WP3細胞色素c基因序列進行BLAST比對分析，推測在異化金屬還原過程中，WP3可能存在兩套電子傳遞系統(tǒng)，即mtrCAB基因簇和mtrFED基因簇。當W

3、P3分別以延胡索酸和二氧化錳為唯一電子受體生長時，通過提取細胞總RNA并將mRNA反轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR（RT-PCR），確定了細胞色素c相關基因轉錄水平的差異。結果表明，在二氧化錳還原過程下，mtrFED基因簇轉錄水平顯著上調。這說明mtrFED基因簇可能在異化金屬還原過程中起著重要作用。
　　由于WP3的mtrFED基因敲除突變株未觀察到二氧化錳還原能力的顯著下降，推測mtrFED基因簇在

4、異化金屬還原過程中可能只是起著輔助作用。為證實mtrFED基因簇在電子傳遞中的作用，首先借助生物信息學工具，對mtrFED基因簇的表達產物即細胞色素c蛋白進行了預測，包括它們的理化性質，跨膜區(qū)段，信號序列和功能結構域等；隨后設計引物，對細胞色素c相關基因在體外進行了克隆表達，并在大腸桿菌中成功表達了具有氧化-還原活性的細胞色素c。
　　同時，本論文發(fā)展了一種基于刪除信號肽的策略來過量表達這些膜蛋白，并采用Qiagen公司的Ni-N