蓮藕多酚氧化酶的純化及環(huán)境因素對(duì)其溶液構(gòu)象的影響.pdf

1、采用磷酸緩沖液為提取溶劑從蓮藕中提取蓮藕多酚氧化酶(PPO)，通過(guò)考察提取方式、提取緩沖液保護(hù)劑、提取時(shí)間及料液比等因素對(duì)酶活性及酶量的影響確定了蓮藕PPO的最佳提取方法；采用硫酸銨分級(jí)沉淀結(jié)合SephadexDEAEA-50及SephadexG-75柱層析等純化步驟實(shí)現(xiàn)了蓮藕PPO的分離純化，并通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行了純度鑒定和分子量測(cè)定。研究了蓮藕PPO的酶學(xué)性質(zhì)，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定了其氨基酸組成，并采用圓二色譜(CD)、

2、熒光光譜(FP)及傅立葉紅外光譜(FT-IR)研究了蓮藕PPO的溶液構(gòu)象。重點(diǎn)研究了溶液微環(huán)境效應(yīng)(包括溫度和pH值)對(duì)蓮藕PPO溶液構(gòu)象的影響，蓮藕PPO與外源性底物、自身底物相互作用以及蓮藕PPO與抑制劑相互作用的光譜學(xué)分析。主要研究結(jié)果如下： 1.蓮藕PPO的提取條件及純化方法 新鮮藕肉去皮打漿后，采用pH值為5.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(含5％PVPP和10％NaCl)提取，料液比為1:2.2，置4℃冰箱中浸

3、提4h，提取的蓮藕PPO活性最大。提取液經(jīng)30％飽和度的硫酸銨除雜，經(jīng)80％飽和度的硫酸銨粉沉淀后，經(jīng)溶解、透析、除鹽后，經(jīng)DEAESephadexA-50及SephadexG-75凝膠柱，收集PPO活性峰，透析除鹽后經(jīng)SDS-PAGE電泳，呈單一染色帶。 2.蓮藕多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)、分子量及結(jié)構(gòu)表征 蓮藕PPO以鄰苯三酚為最適底物，其最適pH為7.0，最適溫度為50℃，Km值為11mmol/L。 經(jīng)SDS-P

4、AGE電泳，比較標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，得出蓮藕PPO的分子量約為21kD。 將蓮藕PPO進(jìn)行氨基酸組成分析，根據(jù)各氨基酸相對(duì)含量和酶的分子量可推算出蓮藕PPO中的氨基酸總和約164個(gè)。其中非極性氨基酸殘基(Ala，Val，Leu，IIe，Pro，Met，Phe，Trp)為39.62％，極性氨基酸(Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asp，Glu，Lys，Arg，His)為57.92％，酸性氨基酸(Asp，Glu)為18.32％，

5、堿性氨基酸(Lys，Arg，His)為10.39％。 采用圓二色譜、熒光光譜及紅外光譜研究了蓮藕PPO的構(gòu)象，結(jié)果表明，濃度為0.3mg/ml的蓮藕PPO，其圓二色譜顯示在209nm和222nm處有雙負(fù)峰，分子中α-螺旋構(gòu)象和β-折疊構(gòu)象分別占43％和57％。熒光光譜顯示最大熒光強(qiáng)度在329nm處，熒光強(qiáng)度為370。結(jié)合氨基酸組成分析，熒光光譜表明Trp殘基和Tyr殘基同時(shí)被激發(fā)后，發(fā)生了從Tyr殘基到Trp殘基之間的能量轉(zhuǎn)移。

6、紅外吸收中有明顯的酰胺I帶和酰胺II帶，分別位于1658cm-1和1544cm-1處，酰胺Ⅲ帶在1240cm-1處有歸屬于α-螺旋構(gòu)象的吸收峰。 3.微環(huán)境效應(yīng)對(duì)蓮藕多酚氧化酶溶液構(gòu)象的影響 不同pH值下蓮藕PPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化：蓮藕PPO在中性pH環(huán)境中活性最高，圓二色譜顯示在209nm和222nm處有雙負(fù)峰，分子中α-螺旋構(gòu)象和β-折疊構(gòu)象分別占43％和57％。熒光光譜顯示最大熒光強(qiáng)度在329nm處，熒光強(qiáng)度為370

7、。隨著pH值的升高或降低，蓮藕PPO的活性和二級(jí)結(jié)構(gòu)都發(fā)生顯著變化，在pH<5和pH>10的條件下，其活性顯著降低，分子中α-螺旋構(gòu)象顯著降低，同時(shí)β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象明顯增加；熒光入max發(fā)生紅移；熒光強(qiáng)度隨著pH值的升高而增強(qiáng)。pH值通過(guò)微擾蓮藕PPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響其活性，蓮藕PPO的活性中心可能位于α-螺旋結(jié)構(gòu)中，蓮藕PPO中α-螺旋構(gòu)象和β-折疊構(gòu)象的合理配置可能是保持其活性的適宜構(gòu)象。 不同溫度下蓮藕PPO的二級(jí)

8、結(jié)構(gòu)變化：隨著溫度的升高，蓮藕PPO活性上升，當(dāng)溫度升高至60℃并保溫?cái)?shù)分鐘后，發(fā)生了熱變性，活性開(kāi)始下降，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中，其α-螺旋構(gòu)象從42.4％降至0.8％，β-折疊構(gòu)象從56.7％上升至83％，無(wú)規(guī)則卷曲含量上升至16.2％。其熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高而下降，最大發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移了3nm。紅外光譜中各酰胺帶均發(fā)生不同程度的位移，且其紅外吸收減小，酰胺Ⅲ帶中1240cm-1處歸屬于α-螺旋構(gòu)象的吸收峰移至1245cm-1。綜上可推知，蓮藕

9、PPO的熱變性溫度為60℃。 4.蓮藕PPO與底物之間的相互作用 活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以鄰苯三酚做底物，蓮藕PPO活性最高。圓二色譜結(jié)果表明，蓮藕PPO與鄰苯三酚、鄰苯二酚、沒(méi)食子酸作用后，其α-螺旋構(gòu)象均顯著降低，β-折疊構(gòu)象升高，無(wú)規(guī)則卷曲含量上升至16.5％左右。鄰苯三酚與PPO相互作用后，其熒光強(qiáng)度下降，峰位不變。鄰苯二酚與PPO相互作用后，其熒光強(qiáng)度顯著上升，沒(méi)食子酸與PPO作用后，Trp殘基紅移最顯著，可能是T

10、rp過(guò)度地暴露所致。從溶液構(gòu)象的變化可知，Trp殘基的過(guò)度暴露不利于蓮藕PPO維持活性構(gòu)象。 應(yīng)用圓二色譜、熒光光譜研究蓮藕自身底物與蓮藕PPO相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，蓮藕PPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)了10.3％的β-轉(zhuǎn)角，其α-螺旋構(gòu)象從37.1％降為12.3％，β-折疊構(gòu)象從62.9％下降至58.5％，無(wú)規(guī)則卷曲含量上升至18.9％。熒光光譜中，Trp殘基的熒光強(qiáng)度增加，最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移至348nm，可知Trp殘基暴露于

11、部分疏水環(huán)境所致，可推知β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為PPO進(jìn)行催化反應(yīng)的重要的中間構(gòu)象，Trp暴露于部分疏水環(huán)境有利于維持PPO催化活性構(gòu)象。 5.蓮藕PPO與抑制劑之間相互作用的研究 測(cè)定了蓮藕PPO在不同酶活抑制劑作用下的酶活性變化情況。比較了幾種常用酶活抑制劑抑制劑A、氯化鈣、半胱氨酸、檸檬酸、EDTA-2Na等對(duì)蓮藕PPO活性的抑制效應(yīng)。結(jié)果表明：抑制劑A、半胱氨酸及氯化鈣對(duì)蓮藕PPO活性的抑制效果較強(qiáng)，抑制率分別為96.2％

12、，86.8％及82.4％。檸檬酸及EDTA抑制效果較低。 圓二色譜結(jié)果表明，抑制劑A嚴(yán)重破壞了蓮藕PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋，其α-螺旋構(gòu)象含量降為0。氯化鈣、半胱氨酸、檸檬酸及EDTA也破壞了蓮藕PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋，但α-螺旋構(gòu)象仍有殘留。加入抑制劑后，蓮藕PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊構(gòu)象含量及無(wú)規(guī)則卷曲含量普遍升高。熒光光譜結(jié)果表明，氯化鈣、半胱氨酸、檸檬酸及EDTA與蓮藕PPO結(jié)合后，其熒光發(fā)射光譜峰位及峰型變化較相