魔芋多酚氧化酶的提取純化、特性及對多糖流變性的影響.pdf

1、魔芋(Konjac，eleplant-footyam)為天南星科魔芋屬(AmorphophallusBlume)植物，廣泛種植于亞洲、非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，目前主要應(yīng)用的是魔芋精粉。在魔芋精粉的加工中，為伎產(chǎn)品色澤潔白，針對新鮮魔芋中的多酚氧化酶(PPO)，采用了一個非常重要的護(hù)色步驟，通過物理方法和添加抑制劑抑制或降低酶活，目前精粉的護(hù)色是采用添加SO2的方法，兼具漂白和鈍化酶活作用，而魔芋精粉中SO2殘留會對其成品活性產(chǎn)生消極的影

2、響，同時(shí)也對人體健康不良。因此，魔芋多酚氧化酶的研究有助于尋找更好的護(hù)色方法。雖然多酚氧化酶的分離與研究已有六十多年的歷史，但是魔芋中的多酚氧化酶的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。結(jié)合實(shí)際情況，該文以新鮮魔芋為研究對象，采用現(xiàn)代分離技術(shù)和先進(jìn)分析測試手段首次提取、分離、鑒定了魔芋中的多酚氧化酶，對其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，對其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了初步探討；分析了多酚氧化酶對多糖流變學(xué)的影響，主要研究結(jié)果如下： 1.魔芋中多酚氧化酶的提取、純化及純度鑒

3、定從新鮮魔芋中提取多酚氧化酶，以不同飽和度的硫酸銨分級沉淀，確定了70％飽和度的分級方法。 根據(jù)魔芋多酚氧化酶為纖維狀蛋白(原子力顯微鏡觀測結(jié)果)的特點(diǎn)，在初步純化后，以G系列葡聚糖凝膠進(jìn)行分離，比較的各種凝膠材料的分離效果，結(jié)果表明以SephadexG-75分離能夠出現(xiàn)多個峰，分離效果較佳，同時(shí)發(fā)現(xiàn)僅以排阻色譜難以得到純酶，采用DEAE-Cellulose-52進(jìn)行預(yù)處理后結(jié)合SephadexG-75，效果良好。 比較

4、不同凝膠的分離結(jié)果曲線，結(jié)合電泳圖，初步判定魔芋中的多酚氧化酶有兩種同工酶，該實(shí)驗(yàn)通過分離純化，得到其中的一種(SDS-PAGE電泳上顯示為一條帶)，分子量為45K左右。 2.魔芋多酚氧化酶結(jié)構(gòu)探討原子力顯微鏡觀察顯示，魔芋中的多酚氧化酶屬于纖維狀蛋白，不能簡單的根據(jù)分子量范圍選擇凝膠進(jìn)行排阻色譜分離。 氨基酸組成分析表明，魔芋多酚氧化酶中谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)及絲氨酸(Ser)含量較高，

5、估計(jì)與C-末端功能域的多個β-鏈形成的反平行β折疊及N-末端的導(dǎo)肽有關(guān)。 X-射線衍射分析結(jié)果表明，以本實(shí)驗(yàn)方法制備的魔芋多酚氧化酶存在部分結(jié)晶，但結(jié)晶度不高(41.65％)，原因可能是提取過程中部分PPO的結(jié)構(gòu)由于變性發(fā)生變化。 園二色性分析測定，魔芋PPO在最適pH下其各二級結(jié)構(gòu)形式比例為：Helix34.8％，Beta28.2％，Turn7.0％，Random30％，加入底物后其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化，a-螺旋比例下

6、降，β-折疊比例上升，說明其活性部位的二級結(jié)構(gòu)形式為a-螺旋；魔芋PPO的二級結(jié)構(gòu)隨pH值變化也發(fā)生一定變化，在最適以外均為a-螺旋比例下降，β-折疊比例上升。 3.魔芋多酚氧化酶酶學(xué)特性與酶對多糖流變性的影響多酚氧化酶在pH接近中性(pH6-7)，溫度30℃時(shí)酶活最高，酶活隨酶濃度、底物濃度升高呈上升趨勢，并逐漸變緩直到達(dá)到最高反應(yīng)酶活。植酸、Na2SO3、VC和EDTA對PPO活性均具有抑制作用，前三者較強(qiáng)，其中以Na2SO

7、3最強(qiáng)，EDTA的抑制作用相對較弱。 魔芋多酚氧化酶對魔芋微粉和超微粉溶膠表觀粘度均有一定影響，原因可能是多酚氧化酶氧化多酚使多糖不易伸展而造成多糖的有效空間旋轉(zhuǎn)半徑減少致使粘度變低；加粗酶和加粗酶、酚組粘度顯著降低，原因可能是粗酶中含有較多葡甘聚糖雜酶所致。 此外，為了尋求酶的最適底物，簡單的比較了三種總酚提取方法比較表明，乙醇濃度過高會導(dǎo)致多酚損失，分析原因是高濃度乙醇中多酚隨多糖一起沉淀所致；同時(shí)乙醇濃度過低也會使