血液成分與骨組織的內(nèi)在聯(lián)系及組織工程學(xué)評價.pdf

1、研究背景及目的： 骨組織工程是模擬體內(nèi)生理性骨再生的過程，血液系統(tǒng)與骨發(fā)生發(fā)育有著分子信號機制上的聯(lián)系，對兩者分子機制的深入探討有助于推動骨組織工程的發(fā)展。 通過GPCR信號通路的分子聯(lián)絡(luò)，血小板構(gòu)成了血液系統(tǒng)和骨再生發(fā)育之間的重要橋梁之一。新近研究的血小板裂解液(PL)是血小板衍生物，承載大量生長因子，抗原物質(zhì)少，制備容易，具有高效絲裂原效應(yīng)，可能成為用于骨組織工程中生長因子的重要來源。 本研究目的旨在：

2、 1、探討血液成分和骨組織之間的分子信號聯(lián)絡(luò)：GPR48基因失活小鼠在胚胎紅系造血和骨發(fā)育調(diào)節(jié)中的共同分子信號通路； 2、將血小板裂解液作為生長因子載體，用于骨組織工程學(xué)方法，評價其在體內(nèi)外對骨再生的影響。 材料和方法： 1.胚胎紅系造血和骨發(fā)育的共同分子信號通路研究 1.1GPR48基因靶向滅活小鼠品系的建立、基因型的確定及表達利用基因分泌捕獲方法建立GPR48基因靶向滅活的小鼠品系(129×C57B

3、L/6)，將GPR48雜合體雌雄小鼠交配飼養(yǎng)繁殖獲得純合突變小鼠子體，取孕中期12.5-14.5天(E12.5-E14.5)的雜合體雌鼠剖離胚胎做相關(guān)研究。 1.2體征觀察觀察E12.5-E14.5胎鼠胚體和肝臟的體態(tài)大小、顏色、活動等一般情況。 1.3外周血紅細胞及血紅蛋白分析制E12.5-E14.5外周血涂片，Wright-Giemsa染色，光鏡下觀察紅細胞形態(tài)變化。 1.4RT-PCR和Western-bl

4、otting對胎肝和骨骼ATF4表達分析提取E13.5WT和HO小鼠胎肝和肋骨籠的RNA和總蛋白，分別用RT-PCR和Western-blotting檢測兩種小鼠胎肝和骨骼中ATF4在mRNA和蛋白水平的表達差異。 1.5組織學(xué)及免疫組化增殖分析取E13.5胎鼠的肝臟，常規(guī)1096中性福爾馬林固定，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切取5pm切片，HE染色，光鏡觀察。 2.用組織工程學(xué)方法評價PL的生物學(xué)效應(yīng)

5、2.1血小板裂解液對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生長和成骨分化的影響 2.1.1BMSCs的分離、培養(yǎng)傳代和表型鑒定成年健康清潔級wistar大鼠8只，體重250-300g，雌雄不限。 2.1.2PL制備及生長因子含量測定取16只大鼠，采用3次離心結(jié)合反復(fù)凍融法制備PL，0.22μm無菌濾膜過濾。 2.1.3PL對細胞生長能力的影響配制含PL終濃度為5％和1％(體積分?jǐn)?shù))兩種不同的條件培養(yǎng)基。 2.1.4PL對B

6、MSCs成骨誘導(dǎo)分化的干預(yù)效應(yīng) 2.1.4.1建立成骨誘導(dǎo)體系取第4代細胞，以含有0.1μmol/L地塞米松、50μg/ml抗壞血酸、10mmol/Lβ-磷酸甘油鈉及10％胎牛血清的H-DMEM為基礎(chǔ)誘導(dǎo)液，配制含PL終濃度為5％和1％(體積分?jǐn)?shù))兩種不同的條件誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別用于A2、B2組細胞的成骨誘導(dǎo)，C2組為不含PL的基礎(chǔ)誘導(dǎo)液作為對照。 2.1.4.2不同PL誘導(dǎo)分化條件下BMSCs的ALP(堿性磷酸酶)活性和

7、礦化形成誘導(dǎo)7天時，各組細胞作ALP染色，觀察胞漿內(nèi)顆粒情況；誘導(dǎo)2、8和12天時，測取各組3個樣本的ALP和TP(總蛋白)含量，以ALP/TP比值作為ALP活性定量指標(biāo)。 2.2PL/ADBG/CG與BMSCs的生物相容性研究 2.2.1同種異體脫鈣骨顆粒(ADBG)的制備 2.2.2Ⅰ型膠原(CG)與ADBG的雙相沉降復(fù)合 2.2.3PL/ADBG/CG制備、復(fù)合培養(yǎng) 2.3體內(nèi)移植評價PL的

8、生物學(xué)效應(yīng) 2.3.1股骨髁缺損造模及材料移植 2.3.2術(shù)后缺損修復(fù)效果評價指標(biāo) 2.3.2.1X線及骨密度計量分析 2.3.2.2組織學(xué)觀察及形態(tài)計量學(xué)分析 2.3.2.3抗壓生物力學(xué)測試A、B、C每組 2.3.2.4三色流式細胞術(shù)測定外周血T-淋巴細胞亞群 2.4統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS11.5軟件包做統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用析因分析交互效應(yīng)，對于單因素效應(yīng)采用O

9、ne-wayANOVA，LSD法用于組間多重比較，P<0.05為統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異。 結(jié)果： 1.Gpr48-cAMP-CREB-ATF4分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)共同調(diào)節(jié)胚胎紅系造血和骨發(fā)育 1.1GPR48基因的靶向滅活及其在胚胎期肝臟和骨組織表達在小鼠Gpr48基因序列的內(nèi)含子l區(qū)中隨機插入了一個較大的分泌型捕獲載體(11.9kb)。 1.2GPR48-/-小鼠發(fā)育遲滯和紅系造血表型大體觀察發(fā)現(xiàn)與WT相比，E12

10、.5-E14.5HO胎鼠身體發(fā)育低下，體型、肝臟均明顯減小，四肢骨骼發(fā)育短小，而且胎體和肝臟的顏色較蒼白，皮下血管細微不發(fā)達。 1.3ATF4在胎肝和骨中的表達分析胎肝和骨RT-PCR結(jié)果顯示，HO胎鼠ATF4在約400bp處出現(xiàn)的條帶亮度明顯弱于WT對照；Western-blotting結(jié)果同樣顯示在約40kD處，HO出現(xiàn)的條帶亮度明顯弱于WT對照。 1.4組織學(xué)及增殖分析肝臟HE染色結(jié)果顯示，純合體與野生型相比，肝細

11、胞形態(tài)類似，但定向紅系祖細胞和紅細胞島明顯減少。 2.用組織工程學(xué)方法評價PL的生物學(xué)效應(yīng) 2.1PL對大鼠體外BMSCs生長和成骨分化的影響 2.1.1BMSCs的分離、培養(yǎng)、傳代和表型鑒定BMSCs經(jīng)分離培養(yǎng)傳至第5代時即純化為單一紡錘狀，規(guī)則平行排列，類似于成纖維細胞形態(tài)。 2.1.2PL中生長因子含量經(jīng)ELISA定量分析，PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF濃度分別為405±59.5

12、8、140±26.65、85.83±16.86和82.5±11.73(pg/mL)。 2.1.3不同濃度PL對BMSCs增殖的影響 2.1.4不同PL條件下對BMSCs成骨誘導(dǎo)分化的影響 2.1.4.1不同誘導(dǎo)條件下對BMSCsALP活性的影響不 2.1.4.2不同誘導(dǎo)條件下對BMSCs基質(zhì)礦化的影響 2.2PL/BDG/CG與BMSCs體外共育的生物相容性共育3、7d，倒置相差顯微鏡顯示BMSC

13、s細胞形態(tài)無明顯異常，材料邊緣及周圍可見大量BMSCs生長。 2.3PL/ADBG/CG體內(nèi)移植對股骨髁缺損修復(fù)重建效果 2.3.1放射學(xué)及骨密度計量學(xué)分析 2.3.2組織學(xué)及組織計量學(xué)分析 2.3.3抗壓生物力學(xué)評價各組標(biāo)本經(jīng)抗壓生物力學(xué)測試，對破斷載荷和破斷強度做方差分析。 2.3.4三色流式細胞術(shù)T細胞亞群測定三色流式細胞術(shù)分析結(jié)果見表2.3.3，經(jīng)方差分析，CD3+CD4+CD8-、CD3

14、+CD8+CD4-、CD4/CD8在各組間均無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論： 血液成分(包括紅細胞和血小板)與骨組織的發(fā)育、再生是存在內(nèi)在聯(lián)系的，血小板裂解液可替代多種生長因子應(yīng)用于骨組織工程方法。 1.GPR48-cAMP-CREB-ATF4分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是紅系造血和骨發(fā)育共同的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號控制通路之一，同時調(diào)控小鼠胚胎期紅細胞的成熟和骨發(fā)育，構(gòu)成連通血液系統(tǒng)和骨骼組織的分子信號橋梁。GPR48的滅活同時造成紅

15、系造血和骨發(fā)育缺陷，這對解釋臨床上某些不明原因的疾病具有潛在的參考價值。 2.GPR48信號通路通過調(diào)節(jié)細胞增殖影響骨和紅細胞發(fā)育。 3.PL由血小板衍生而來，是多種生長因子的承載體系，可參與骨形成調(diào)控。PL以劑量依賴方式，對大鼠BMSCs發(fā)揮絲裂原作用，促進細胞增殖；而對BMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中的ALP活性和礦化形成呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制作用。PL對BMSCs增殖和分化的不一致效應(yīng)可能對早期骨修復(fù)有利。 4.