血管神經(jīng)化組織工程骨修復(fù)兔股骨缺損的早期組織學(xué)研究.pdf

1、研究目的： 隨著骨組織工程研究深入以及向臨床過渡的逐漸展開，一個主要的問題就是如何構(gòu)建大塊組織工程骨在體內(nèi)存活并發(fā)揮功能作用，充分的血液供應(yīng)是最初和最基本的環(huán)節(jié)，有決定性影響。如不能建立有效的血循環(huán)，組織工程骨只能被限制在修復(fù)小、薄的骨缺損。而神經(jīng)系統(tǒng)對于骨組織的生長、發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)都具有重要的作用。在動物(新西蘭大白兔)體內(nèi)制造股骨大段骨缺損模型，利用組織工程學(xué)方法，采用顯微外科技術(shù)，分別構(gòu)建神經(jīng)化、血管化的組織工程骨在體內(nèi)修

2、復(fù)大段骨缺損。通過對血管化、神經(jīng)化的組織工程骨修復(fù)骨缺損的效果進(jìn)行大體和組織學(xué)的觀察與比較，探討神經(jīng)化、血管化在組織工程化骨構(gòu)建中的作用，為其在臨床的應(yīng)用提供依據(jù)。 1、研究在大段組織工程骨內(nèi)分別植入感覺神經(jīng)束、運(yùn)動神經(jīng)束、感覺與運(yùn)動神經(jīng)束對大段組織工程骨早期成骨的影響，并利用免疫組化染色來初步探討促進(jìn)成骨的機(jī)制。 2、比較感覺神經(jīng)束植入與血管束植入對大段組織工程骨早期成骨的影響，并利用免疫組化染色來初步探測其促進(jìn)成骨的

3、機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、神經(jīng)束植入對大段組織工程骨成骨影響的實(shí)驗(yàn)研究1、1將6月齡成年新西蘭大白兔48只，分別通過穿刺從髂前上嵴抽取骨髓，提取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，與帶側(cè)槽的β-磷酸三鈣復(fù)合制作組織工程骨；分別將不同類型神經(jīng)束植入組織工程骨的側(cè)槽中，進(jìn)行以下分組：A組，組織工程骨組；B組，運(yùn)動神經(jīng)束植入組(股神經(jīng)肌支)；C組，感覺神經(jīng)束植入組(隱神經(jīng))；D組，感覺、運(yùn)動神經(jīng)束聯(lián)合植入組(隱神經(jīng)+股神

4、經(jīng)肌支)。制造兔股骨1.5cm大段骨缺損，采用四孔鋼板固定，在缺損處植入構(gòu)建好的組織工程骨，再植入相應(yīng)的神經(jīng)。 1、2各組分別在術(shù)后4、8、12w取材，進(jìn)行大體標(biāo)本觀察。再對骨缺損區(qū)組織以40g/L的多聚甲醛固定，150g/L的乙二胺四乙酸脫鈣后石蠟包埋，行HE及Masson染色，采用圖像分析方法分析新生骨小梁面積象素值，并計算其占視野總面積象素值的百分?jǐn)?shù)。按4×3析因設(shè)計方差分析將數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學(xué)處理，若有顯著差異再以LSD法行多

5、重比較，用以比較骨缺損區(qū)的修復(fù)情況。 1、3對各組標(biāo)本行降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene relatedpeptide，CGRP)及S-100的免疫組化染色。圖像分析測定陽性染色的灰度值，再計算出每張切片的平均灰度值(平均灰度值與免疫表達(dá)強(qiáng)度呈反比)。分別按4×3析因設(shè)計方差分析將數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學(xué)處理，若有顯著差異再以LSD法行多重比較，初步探討促進(jìn)成骨的機(jī)制。 2、血管神經(jīng)化對大段組織工程骨成骨影響的比較研

6、究 2、1將6月齡成年新西蘭大白兔36只，制作組織工程骨的方法同第一部分；將血管束、感覺神經(jīng)束分別植入組織工程骨的側(cè)槽中，進(jìn)行以下分組：A組，組織工程骨組；B組，血管束植入組(含有自主神經(jīng))；C組，感覺神經(jīng)束植入組(隱神經(jīng))。制造兔股骨1.5cm大段骨缺損，采用四孔鋼板固定，在缺損處植入構(gòu)建好的組織工程骨，再植入相應(yīng)的血管神經(jīng)束。 2、2各組分別在術(shù)后4、8、12w取材，進(jìn)行大體標(biāo)本觀察，再對骨缺損區(qū)組織以40g/L的多

7、聚甲醛固定，150g/L的乙二胺四乙酸脫鈣后石蠟包埋，行HE及Masson染色，采用圖像分析方法分析新生骨小梁面積象素值，并計算其占視野總面積象素值的百分?jǐn)?shù)。按3×3析因設(shè)計方差分析將數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學(xué)處理，若有顯著差異再以LSD法行多重比較，用以比較骨缺損區(qū)的修復(fù)情況。 2、3對各組標(biāo)本行降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)及神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y，NPY)的免

8、疫組化染色。圖像分析測定陽性染色的灰度值，再計算出每張切片的平均灰度值(平均灰度值與免疫表達(dá)強(qiáng)度呈反比)。按3×3析因設(shè)計方差分析將數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學(xué)處理，若有顯著差異再以LSD法行多重比較，初步探討其促進(jìn)成骨的機(jī)制。 結(jié)果： 1、神經(jīng)植入對大段組織工程骨成骨影響的實(shí)驗(yàn)研究1、1大體觀察：術(shù)后各時間點(diǎn)、各組都有不同程度的新生骨痂形成，以C組與D組的骨痂量多于A組與B組。 1、2組織學(xué)觀察及統(tǒng)計學(xué)分析：隨著時間的延長，各

9、組的新生骨組織都有不同程度的增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=456.427，P<0.000)。各組間的新生骨組織量有顯著性差異(F=112.359，P<0.000)，從各時間點(diǎn)看，每一時間點(diǎn)各組的新生骨組織量均有顯著性差異。時間點(diǎn)與神經(jīng)植入之間存在的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.111，P=0.015)。對每一時間點(diǎn)用LSD法行多重比較可見，在各時間點(diǎn)C組(感覺神經(jīng)束植入組)與D組(感覺、運(yùn)動神經(jīng)束聯(lián)合植入組)均多于A組(單純組織工程骨組)

10、與B組(運(yùn)動神經(jīng)束植入組)，C組與D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，A組與B組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 1、3 CGRP、S-100的免疫組化染色及統(tǒng)計學(xué)分析：對植入物區(qū)新生骨組織內(nèi)CGRP染色灰度值的統(tǒng)計學(xué)分析顯示隨著時間的延長，各組新生骨組織內(nèi)CGRP的表達(dá)量都有不同程度的增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=258.046，P<0.000)。各組間的新生骨組織內(nèi)CGRP的表達(dá)量有顯著性差異(F=689.552，P<0.000)。時間點(diǎn)與神經(jīng)植入之

11、間存在的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.915，P=0.015)。多重比較顯示各時間點(diǎn)C組(感覺神經(jīng)束植入組)與D組(感覺、運(yùn)動神經(jīng)束聯(lián)合植入組)均多于A組(單純組織工程骨組)與B組(運(yùn)動神經(jīng)束植入組)，C組與D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，A組與B組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 對植入物區(qū)新生骨組織內(nèi)S-100染色灰度值的統(tǒng)計學(xué)分析顯示隨著時間的延長，各組新生骨組織內(nèi)S-100的表達(dá)量都有不同程度的增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=346.524，

12、P<0.000)；各組間的新生骨組織內(nèi)S-100的表達(dá)量有顯著性差異(F=713.807，P<0.000)。時間點(diǎn)與神經(jīng)植入之間存在的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.906，P=0.020)。多重比較顯示各時間點(diǎn)C組(感覺神經(jīng)束植入組)與D組(感覺、運(yùn)動神經(jīng)束聯(lián)合植入組)均多于A組(單純組織工程骨組)與B組(運(yùn)動神經(jīng)束植入組)，C組與D組間無差異，A組與B組問無差異。 2、血管神經(jīng)化對大段組織工程骨成骨影響的比較研究 2、

13、1大體觀察：術(shù)后各時間點(diǎn)、各組都有不同程度的新生骨形成，以B組與C組的骨痂量優(yōu)于A組。 2、2組織學(xué)觀察及統(tǒng)計學(xué)分析：對植入物區(qū)新生骨組織評分結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析顯示隨著時間的延長，新生骨組織都有不同程度的增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=105.735，P<0.000)。各組間的新生骨組織量有顯著性差異(F=290.008，P<0.000)。時間點(diǎn)與神經(jīng)植入之間存在的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.177，P=0.029)。對每一時間點(diǎn)用

14、LSD法行多重比較可見，在4w時B組(血管束植入組)優(yōu)于A組(單純組織工程骨組)與C組(感覺神經(jīng)束植入組)，C組多于A組；在8w和12w時，B組與C組均多于A組，B組與A組之間無差別。 2、3 CGRP及NPY的免疫組化染色及統(tǒng)計學(xué)分析：對植入物區(qū)新生骨組織內(nèi)CGRP灰度值的統(tǒng)計學(xué)分析顯示隨著時間的延長，新生骨組織內(nèi)CBRP的表達(dá)都有不同程度的增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=95.392，P<0.000)。各組間的新生骨組織內(nèi)CGR

15、P的表達(dá)量有顯著性差異(F=415.324，P<0.000)。時間點(diǎn)與神經(jīng)植入之間存在的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.475，P<0.000)。對每一時間點(diǎn)各組間用LSD法行多重比較可見，在4w時B組(血管束植入組)多于A組(單純組織工程骨組)與C組(感覺神經(jīng)束植入組)，而C組多于A組，而在8w和12w時，B組與C組均多于A組，B組與A組之間無差別。 對植入物區(qū)新生骨組織內(nèi)NPY灰度值的統(tǒng)計學(xué)分析顯示隨著時間的延長，新生骨組織

16、內(nèi)NPY的表達(dá)都有不同程度的增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=892.240，P<0.000)。各組間的新生骨組織內(nèi)NPY的表達(dá)量有顯著性差異(F=118.373，P<0.000)。時間點(diǎn)與神經(jīng)植入之間存在的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.509，P<0.000)。多重比較顯示在4w時B組(血管束植入組)多于A組(單純組織工程骨組)與C組(感覺神經(jīng)束植入組)，而C組多于A組；在8w和12w時，B組與C組均多于A組，B組與A組之間無差別。

17、 結(jié)論： 1、在組織工程骨內(nèi)植入感覺神經(jīng)或感覺神經(jīng)聯(lián)合運(yùn)動神經(jīng)在早期可促進(jìn)成骨，而單純植入運(yùn)動神經(jīng)未見明顯促進(jìn)作用。 2、感覺神經(jīng)植入或感覺神經(jīng)聯(lián)合運(yùn)動神經(jīng)植入大段組織工程骨內(nèi)可促進(jìn)CGRP、S-100在新生骨組織內(nèi)的表達(dá)，而植入運(yùn)動神經(jīng)卻無此作用。 3、大段組織工程骨內(nèi)植入血管束在4w時的促組織工程骨的生長作用要優(yōu)于感覺神經(jīng)植入，但在8w與12w時與感覺神經(jīng)植入無顯著差異。 4、血管束植入大段組織工程