針刺及針藥結(jié)合對急性手術(shù)創(chuàng)傷大鼠的鎮(zhèn)痛效應及中樞Orexin系統(tǒng)參與針刺鎮(zhèn)痛的研究.pdf

1、急性手術(shù)創(chuàng)傷所致的術(shù)后疼痛是外科手術(shù)后出現(xiàn)的手術(shù)傷口局部疼痛，屬急性疼痛范疇。有資料顯示，外科手術(shù)后疼痛發(fā)生率高達19％-56％，其發(fā)生與手術(shù)麻醉方式的選擇等因素密切相關(guān)，疼痛程度以中度為主。術(shù)后疼痛嚴重影響患者的生存質(zhì)量，因此選擇安全、有效、生理干擾小的麻醉方式是解決外科術(shù)后疼痛的主要途徑之一。
　　針刺鎮(zhèn)痛是我國傳統(tǒng)醫(yī)學的特色，以其確切的臨床療效在臨床應用中一直有著活躍的生命力。多項臨床資料顯示，針刺可廣泛應用于顱腦手術(shù)、甲狀

2、腺切除術(shù)、肺切除術(shù)、胃切除術(shù)、膽囊切除術(shù)等多種外科手術(shù)，針刺不但能夠緩解患者的術(shù)后疼痛，而且能夠調(diào)節(jié)免疫功能，促進創(chuàng)傷的恢復。深入研究針刺在手術(shù)創(chuàng)傷后疼痛中的作用對于闡釋針刺鎮(zhèn)痛的機理具有重要的意義。
　　回顧針刺鎮(zhèn)痛機理研究歷程可以發(fā)現(xiàn)，早期針刺鎮(zhèn)痛實驗研究主要以急性傷害性疼痛刺激為致痛因素，與臨床疾病有一些差異。目前對于模擬臨床外科手術(shù)急性創(chuàng)傷的針刺研究很少，主要是因為缺少與臨床外科手術(shù)相對應的急性痛動物模型，因此為了深入開展

3、針刺對于急性手術(shù)創(chuàng)傷疼痛的實驗研究，急需建立急性手術(shù)創(chuàng)傷疼痛的小動物實驗模型。其基本要求一是模擬臨床手術(shù)操作造成的急性手術(shù)創(chuàng)傷和疼痛，二是能及時進行針刺干預并進行疼痛的測試。這對于研究針刺鎮(zhèn)痛和針刺麻醉的機制，顯然是十分重要的。
　　針刺鎮(zhèn)痛機制的主要研究成果有針刺鎮(zhèn)痛的神經(jīng)通路機制和針刺鎮(zhèn)痛的神經(jīng)化學機制兩個方面。阿片肽與針刺鎮(zhèn)痛的關(guān)系因首先被證實而成為經(jīng)典，而后非阿片肽系統(tǒng)在針刺鎮(zhèn)痛機制中的作用也吸引了更多的研究興趣。以往研究

4、已發(fā)現(xiàn)，針刺鎮(zhèn)痛效應與中樞內(nèi)多種神經(jīng)肽有關(guān)，包括P物質(zhì)(SP)，血管活性腸肽(VIP)，神經(jīng)肽Y(NPY)等。
　　Orexin是一種完全由下丘腦生成的神經(jīng)肽，分Orexin A和B兩種(OXA，OXB)，分別是33肽和28肽，它們均由一種前體Prepro-Orexin生成。Orexin的受體是G蛋白偶聯(lián)受體，有OX1R和OX2R兩種亞型。Orexin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有廣泛的纖維投射，同時參與多種生理過程，包括睡眠覺醒、進食行為、

5、心臟自律性以及神經(jīng)內(nèi)分泌。近年來越來越多的研究支持Orexins尤其是OXA在痛覺調(diào)制過程中可能發(fā)揮著重要的作用。首先是在痛覺調(diào)制的各水平，包括中腦導水管周圍灰質(zhì)(PAG)、延髓頭端腹內(nèi)側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(RVM)、脊髓背角(DH)和背根神經(jīng)節(jié)(DRG)均存在下丘腦OXA能纖維直接投射;其次，行為學依據(jù)也表明，中樞給予外源性OXA對機械痛、熱痛有抑制作用，且其抗傷害作用不被納絡酮阻斷。以上證據(jù)提示OXA不但參與脊髓與脊髓上抗傷害反應過程，亦可能

6、是通過參與疼痛的下行抑制系統(tǒng)進而調(diào)節(jié)疼痛感受，且OXA可能是存在于阿片肽系統(tǒng)外的鎮(zhèn)痛物質(zhì)。
　　那么針刺鎮(zhèn)痛過程是否也調(diào)動了OXA的激活，OXA對于針刺鎮(zhèn)痛是協(xié)同作用還是拮抗作用，其進一步機制又如何？為了驗證這一假說，我們采用改良的開腹手術(shù)建立的急性術(shù)后疼痛大鼠模型，從行為學到形態(tài)學等不同方面，從整體到分子等不同水平，運用機械痛和熱痛測定方法，結(jié)合免疫組織化學、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應、酶聯(lián)免疫吸附試驗和激光共聚焦等方法，對針刺及針藥

7、結(jié)合對急性手術(shù)創(chuàng)傷后疼痛的協(xié)同鎮(zhèn)痛作用和中樞Orexin系統(tǒng)參與針刺鎮(zhèn)痛的機理研究進行探討。
　　實驗結(jié)果如下:
　　1.急性手術(shù)創(chuàng)傷模型的建立及評價
　　1.1麻醉藥乙醚對大鼠機械痛閾及熱痛閾的影響
　　為了排除麻醉藥乙醚對大鼠痛閾的影響，大鼠隨機分為正常組和麻醉組，每組各8只，麻醉組大鼠進行乙醚全身麻醉并維持15min。結(jié)果顯示，與正常組相比，乙醚麻醉組大鼠的足機械痛閾(PWT)、腹機械痛閾(ACT)、足熱痛

8、閾(PWL)、熱水甩尾潛伏期(TFL)均無顯著改變(P＞0.05)。因足機械痛與腹機械痛均顯示出較穩(wěn)定的閾值，故后續(xù)試驗采用該兩項指標進行痛閾測定。
　　1.2急性手術(shù)創(chuàng)傷對大鼠腹機械痛和足機械痛閾的影響
　　大鼠隨機分為正常組，假手術(shù)組和模型組，每組各8只。在乙醚吸入麻醉下進行大鼠腹部正中切口手術(shù)。假手術(shù)組是麻醉維持15分鐘，腹部剃毛、消毒。結(jié)果顯示，模型組大鼠術(shù)后0.5h時腹部即出現(xiàn)痛覺超敏并持續(xù)至24 h以上，與假手術(shù)

9、組相比均具有顯著性差異(P＜0.01)。而假手術(shù)組與正常組相比沒有明顯的痛閾改變。足部機械性閾值測定結(jié)果顯示，假手術(shù)組與正常組相比沒有明顯的痛閾改變。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠術(shù)后0.5 h時足部開始出現(xiàn)痛覺超敏并持續(xù)至24 h，與正常組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　上述實驗初步揭示了急性手術(shù)創(chuàng)傷疼痛造模及痛閾測定方法是切實可行的。
　　1.3芬太尼對模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用
　　為進一步驗證大鼠急性手術(shù)創(chuàng)傷模型

10、用于痛與鎮(zhèn)痛實驗的可靠性，采用麻醉鎮(zhèn)痛藥芬太尼外周給藥，觀察模型大鼠痛閾的變化。大鼠隨機分為生理鹽水組（Saline組）、芬太尼小劑量組、中劑量組和大劑量組，分別于術(shù)后即刻給予Saline0.2 ml、芬太尼5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg肌肉注射。結(jié)果顯示，芬太尼10μg/kg與20μg/kg能夠劑量依賴性緩解大鼠腹部切口痛敏和足部痛敏，作用維持時間至術(shù)后2h，與Saline組相比具有顯著性差異（腹部P＜0.01，足部P＜

11、0.05）。小劑量芬太尼(5μg/kg)并不能緩解模型大鼠的腹部切口痛敏及足部痛敏。本測痛實驗中PWT與ACT這兩個測痛指標對最大鎮(zhèn)痛效果的反應無統(tǒng)計學差異。
　　小結(jié):腹部正中切口手術(shù)所致急性創(chuàng)傷模型能夠引起大鼠腹部和足部機械性痛敏，且痛敏持續(xù)達24 h以上。10μg/kg和20μg/kg芬太尼能夠劑量依賴性緩解該急性手術(shù)創(chuàng)傷所致的疼痛。實驗顯示，該急性手術(shù)創(chuàng)傷大鼠的測痛模型是穩(wěn)定可靠的。
　　2.電針對手術(shù)創(chuàng)傷模型大鼠急

12、性痛的鎮(zhèn)痛作用
　　2.12/15Hz和2/100Hz電針對模型大鼠腹機械痛和足機械痛的影響
　　大鼠隨機分為模型組、假電針組、電針2/15Hz組和電針2/100Hz組，每組8-11只。電針結(jié)束后0.5h，1h，2h，4h，6h及24 h時測定腹機械痛和足機械痛。腹部測痛結(jié)果顯示，與模型組相比，術(shù)后0.5 h及1h時，兩種頻率電針對于腹部痛敏均有顯著緩解作用，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);0.5 h時，電針2/15Hz組

13、與假電針組相比也有顯著性差異(P＜0.05)。但電針2/100Hz組與假電針組相比具有差異趨勢，但尚未達到顯著性差異。
　　足部測痛結(jié)果顯示，術(shù)后0.5 h時，兩種頻率電針均能緩解足部機械痛敏，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，其中0.5h時電針2/15 Hz組與假電針組相比也有顯著性差異(P＜0.05)。但電針2/100Hz組與假電針組相比具有差異趨勢而尚未達到顯著性差異。
　　2.2電針與芬太尼合用對模型大鼠腹機

14、械痛和足機械痛的影響
　　基于以上實驗結(jié)果，2/15Hz電針即刻鎮(zhèn)痛效應較2/100Hz明顯，因此選擇2/15Hz作為后續(xù)實驗的電針參數(shù)。為觀察電針合用小劑量芬太尼的協(xié)同鎮(zhèn)痛作用，大鼠隨機分為Saline組（術(shù)后即刻注射Saline0.2 ml作為對照）、小劑量芬太尼組(5μg/kg)、電針合用Saline組、電針合用小劑量芬太尼組，每組7-8只。結(jié)果顯示，小劑量芬太尼(5μg/kg)注射后，腹部痛閾及足部痛閾與Saline組相比

15、沒有明顯改變(P＞0.05)。與Saline組相比，電針合用Saline組0.5 h時的腹部痛閾及足部痛閾顯著提高，差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　腹部痛閾測定結(jié)果還顯示，與小劑量芬太尼組相比，電針合用小劑量芬太尼組腹部痛閾在0.5 h、1h及24 h時均明顯升高，兩者比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);與電針合用Saline組相比，電針合用小劑量芬太尼組腹部痛閾均值在術(shù)后24 h有升高趨勢。
　　足部痛閾測定結(jié)果還

16、顯示，與小劑量芬太尼組相比，電針合用小劑量芬太尼組足部痛閾在0.5 h、1h和4h至24 h內(nèi)均明顯升高，兩者比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);與電針合用生理鹽水組相比，電針合用小劑量芬太尼組足部痛閾均值在0.5h、6h及24 h時均明顯升高，兩者比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　小結(jié):2/15Hz和2/100Hz兩種頻率電針對急性術(shù)后痛大鼠均有即刻鎮(zhèn)痛效應。與單獨使用電針或小劑量芬太尼相比，2/15Hz電針與小劑量芬太尼合

17、用后對腹部和足部機械性痛閾的均值均有提高，不但即刻鎮(zhèn)痛效果得到顯著增強，而且出現(xiàn)后續(xù)的鎮(zhèn)痛效應，時程明顯延長。
　　3.鞘內(nèi)注射OXA、納洛酮及選擇性OX1R受體拮抗劑SB-334867對急性手術(shù)創(chuàng)傷模型大鼠腹機械痛及電針鎮(zhèn)痛的影響
　　3.1鞘內(nèi)注射OXA對模型大鼠腹機械痛閾的影響
　　大鼠隨機分為Saline組、OXA小劑量組、OXA中劑量組、OXA大劑量組，每組6-8只，手術(shù)結(jié)束后立即鞘內(nèi)注射Saline10μl

18、、OXA0.1 nmol、0.3nmol和1nmol。隨即進行痛閾測定。結(jié)果顯示，與Saline對照組相比，OXA0.1nmol對模型大鼠痛閾沒有明顯作用。注射后0.5 h，OXA0.3 nmol和1nmol均能夠升高大鼠腹部機械性閾值，與Saline組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。OXA0.3nmol和1nmol兩組之間無統(tǒng)計學差異。
　　3.2鞘內(nèi)注射選擇性OX1R拮抗劑SB-334867及納絡酮對OXA鎮(zhèn)痛作用的影響

19、r>　　大鼠隨機分為Saline組、OXA0.3nmol組、SB-33486730nmol組、SB-33486730nmol+OXA0.3nmol組和納絡酮28nmol+OXA0.3nmol組，每組7-8只。 SB-33486730nmol及納絡酮28nmol為手術(shù)前鞘內(nèi)注射，OXA與Saline為術(shù)后即刻鞘內(nèi)注射。結(jié)果顯示，術(shù)后0.5 h時，與Saline組相比，OXA0.3nmol組的ACT明顯升高(P＜0.05)，而SB-3348

20、6730nmol組大鼠的痛閾沒有顯著改變(P＞0.05);SB33486730 nmol+OXA0.3nmol組與OXA0.3nmol組相比，腹機械痛閾升高不明顯，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。納絡酮28nmol+OXA0.3nmol組腹機械痛閾與OXA0.3nmol組相比沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。表明OXA的鎮(zhèn)痛作用可被OX1R拮抗劑所阻斷，但不被阿片受體拮抗劑納洛酮所阻斷。
　　3.3鞘內(nèi)注射OXA對電針鎮(zhèn)痛的影響

21、r>　　大鼠隨機分為Saline組、電針組、OXA0.3nmol組和電針+OXA0.3nmol組，每組8-11只。電針結(jié)束后即刻注射OXA0.3nmol。結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射OXA0.3nmol后1h，與OXA0.3nmol組相比，電針+OXA0.3nmol組大鼠腹部機械性閾值顯著增加，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。與電針組相比，電針+OXA0.3nmol組的腹部機械痛閾有升高趨勢。
　　3.4鞘內(nèi)注射選擇性OX1R拮抗劑SB-3

22、34867對電針鎮(zhèn)痛的影響
　　大鼠隨機分為DMSO組、電針組、SB-33486730nmol組、SB-334867100nmol組、SB-33486730nmol+電針組和SB-334867100nmol+電針組，每組7-11只。結(jié)果顯示，與DMSO組相比，SB-33486730nmol和SB-334867100nmol對模型大鼠的痛閾無明顯影響(P＞0.05);與電針組相比，SB-334867100nmol+電針組痛閾明顯降低

23、，兩者相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。但SB-33486730nmol+電針組與電針組相比，痛閾沒有顯著差異(P＞0.05)。
　　3.5鞘內(nèi)注射選擇性OX1R拮抗劑SB-334867100nmol對芬太尼鎮(zhèn)痛的影響
　　大鼠隨機分為Saline組、芬太尼10μg/kg組、SB-334867100nmol組和SB-334867100nmol+芬太尼10μg/kg組，每組7-8只。SB-334867為術(shù)前即刻鞘內(nèi)注射，芬太尼

24、為術(shù)后即刻肌肉注射。結(jié)果顯示，與Saline組相比SB-334867100nmol組痛閾沒有顯著改變;0.5h和1h時，芬太尼10μg/kg組和SB-334867100nmol+芬太尼10μg/kg組與Saline組比較分別具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，芬太尼10μg/kg組和SB-334867100nmol+芬太尼10μg/kg組之間比較沒有統(tǒng)計學差異，即預先鞘內(nèi)注射SB-334867100nmol對芬太尼引起的腹部機械性閾值升高沒

25、有顯著影響(P＞0.05)。
　　小結(jié):
　　(1)鞘內(nèi)注射OXA對急性手術(shù)創(chuàng)傷模型大鼠具有鎮(zhèn)痛作用，OXA合用電針后鎮(zhèn)痛效果增強;
　　(2)鞘內(nèi)注射選擇性OX1R拮抗劑能夠拮抗OXA產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用，SB-334867大劑量(100nmol)能拮抗電針的鎮(zhèn)痛作用。
　　(3)μ阿片受體拮抗劑納絡酮不能拮抗OXA產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用，SB-334867100nmol也未能拮抗μ阿片受體激動劑芬太尼的鎮(zhèn)痛效果。
　

26、　綜上，中樞OXA可能通過OX1R介導參與電針對急性手術(shù)創(chuàng)傷的鎮(zhèn)痛作用。
　　4.電針對大鼠中樞OXA及OX1R表達的影響
　　4.1電針對模型大鼠下丘腦、PAG和脊髓OXA蛋白含量的影響
　　運用ELISA方法檢測正常組、模型組、電針2/15Hz組和電針2/100Hz組下丘腦、PAG和脊髓中OXA的蛋白含量。結(jié)果顯示，與正常組相比，手術(shù)后1h時模型組大鼠下丘腦、PAG和脊髓的OXA含量顯著減少，兩者比較有統(tǒng)計學差異(

27、P＜0.05);與模型組相比，電針2/15Hz可以顯著上調(diào)下丘腦、PAG和脊髓的OXA的含量，兩者比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。電針2/100Hz組下丘腦、PAG和脊髓OXA的表達和模型組相比沒有顯著差異。
　　4.2電針對模型大鼠下丘腦OXA mRNA表達的影響
　　運用RT-PCR方法檢測術(shù)后2h、4h兩個時間點正常組、模型組和電針2/15Hz組下丘腦OXA的mRNA表達。結(jié)果顯示，與正常組相比，術(shù)后2h下丘腦OXA

28、mRNA表達下降(P＜0.05);與模型組相比，電針可以顯著增加下調(diào)的OXA mRNA(P＜0.05)。而術(shù)后4h各組之間OXA mRNA表達沒有顯著差異。
　　4.3電針對模型大鼠下丘腦Orexin能神經(jīng)元表達的影響
　　運用免疫組化方法檢測正常組、模型組、電針2/15Hz組和電針2/100Hz組大鼠下丘腦Orexin能神經(jīng)元的表達。結(jié)果顯示，術(shù)后2h時，與正常組相比，模型組和電針組下丘腦Orexin能神經(jīng)元表達均沒有顯著

29、改變。
　　4.4正常大鼠下丘腦、PAG、延髓和脊髓OX1R的表達
　　OXA的功能要通過與受體結(jié)合而發(fā)揮。運用免疫組化法標記正常大鼠下丘腦、中腦、延髓和脊髓的OX1R表達。結(jié)果顯示，在下丘腦腹側(cè)、PAG、延髓腹內(nèi)側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和脊髓背角，OX1R呈陽性表達與分布。
　　4.5電針對模型大鼠下丘腦、PAG、脊髓OX1R mRNA表達的影響
　　運用RT-PCR方法檢測正常組、模型組、電針2/15Hz組和電針2/100

30、Hz組大鼠術(shù)后2h下丘腦OX1R mRNA的表達。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組下丘腦OX1R mRNA表達上調(diào);與模型組相比，電針2/15Hz組能夠進一步上調(diào)下丘腦OX1R的表達(P＜0.05)，而電針2/100Hz組沒有明顯變化。
　　同樣方法檢測術(shù)后2 h PAG中OX1R mRNA的表達，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組PAG OX1R mRNA表達下調(diào);與模型組相比，電針組能夠顯著上調(diào)PAG中OX1R的表達(P＜0.05)

31、，而電針2/100Hz組沒有明顯變化。
　　同樣方法檢測術(shù)后2h脊髓OX1R mRNA的表達，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組脊髓OX1R mRNA表達下調(diào);與模型組相比，電針組能夠上調(diào)脊髓OX1R的表達(P＜0.05)，而電針2/100Hz組沒有明顯變化。
　　4.6模型大鼠術(shù)后下丘腦Orexin能神經(jīng)元纖維投射
　　運用免疫雙標的方法，觀察OXA-LI陽性細胞與NeuN的雙標，結(jié)果顯示，OXA主要存在于NeuN陽性神

32、經(jīng)元的胞漿中;且手術(shù)后Orexin能纖維投射可見明顯變粗。
　　小結(jié):手術(shù)后2h，模型大鼠下丘腦、PAG與脊髓的OXA含量減少，下丘腦OXAmRNA表達下調(diào)，而電針能夠上調(diào)OXA的含量及OXA mRNA的表達;模型大鼠下丘腦OX1R mRNA表達上調(diào)，而PAG和脊髓OX1R mRNA表達下調(diào)，而電針能夠在原有基礎上進一步上調(diào)OX1R mRNA的表達。提示電針有可能通過調(diào)控中樞Orexin系統(tǒng)而實現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用。
　　結(jié)論:

33、>　　圍手術(shù)期針刺對大鼠急性手術(shù)創(chuàng)傷后疼痛有即刻鎮(zhèn)痛效應，電針與小劑量芬太尼合用能夠增強電針鎮(zhèn)痛的效應，并能延長電針鎮(zhèn)痛時程;鞘內(nèi)注射OXA可以緩解急性手術(shù)創(chuàng)傷后疼痛，納洛酮未能拮抗OXA的鎮(zhèn)痛效果，鞘內(nèi)注射選擇性OX1R拮抗劑SB-334867能夠分別拮抗OXA以及電針的鎮(zhèn)痛效果，但不能拮抗芬太尼鎮(zhèn)痛效果;電針能夠上調(diào)急性創(chuàng)傷大鼠下丘腦、PAG和脊髓內(nèi)源性OXA和OX1R mRNA的表達，以上提示OXA可能通過下行抑制系統(tǒng)的OX1R參