誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染對雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞的影響.pdf

1、前列腺癌是老年男性疾病，為西方國家最常見的腫瘤，死亡率高居第二位。隨著人們生活水平的提高，我國的前列腺癌發(fā)病率也顯著上升。手術(shù)治療、藥物治療、放射治療和生物治療是目前疾病治療的4大療法，雖然早期手術(shù)切除是根治前列腺癌的根本方法，但50％患者在確診時(shí)都已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常規(guī)的手術(shù)、內(nèi)分泌及化學(xué)療法均難以明顯提高這些患者的生存期。尋找新的治療前列腺癌的方法迫在眉睫。一氧化氮以其雙重的生物學(xué)效應(yīng)在腫瘤研究中得到了普遍的重視，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的低濃度

2、NO促進(jìn)腫瘤生長，而高濃度NO具有抗腫瘤作用。因此激發(fā)腫瘤細(xì)胞釋放大量的NO可能是一個(gè)抗腫瘤的新方法。多種途徑可以達(dá)到高濃度NO，例如在鼠黑色素瘤和人腎細(xì)胞癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染iNOS基因，達(dá)到了抑制腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的效果。NOS基因轉(zhuǎn)移已在大量心血管疾病動(dòng)物模型和某些人類組織上得到了證實(shí)，其表達(dá)能有效調(diào)節(jié)局部血管功能、抑制細(xì)胞增殖和遷移、且不干擾全身血液循環(huán)，明顯優(yōu)于直接補(bǔ)充外源NO。顯示了NOS基因治療心血管疾病的可能性和優(yōu)越性。因此內(nèi)源性和

3、外源性的NOS將會是很有前途的治療劑或化療輔助劑，相對其他領(lǐng)域而言，一氧化氮在前列腺癌中生物學(xué)效應(yīng)的研究還有一定的差距。目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道將iNOS應(yīng)用于雄激素非依賴型前列腺癌。 我們在前期工作中，通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，以SNP為外源性NO供體，研究外源性一氧化氮(NO)對前列腺癌細(xì)胞增值的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。我們認(rèn)為外源性一氧化氮(NO)對前列腺癌ALAV-31細(xì)胞有雙重的生物效用：即低濃度的SNP可以促進(jìn)其生長

4、，該機(jī)制可能是通過NO-cGMP途徑激活信使傳導(dǎo)，也可能在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞的生長。而高濃度SNP所釋放的NO可以上調(diào)p21wafl/cipl基因，通過其蛋白的表達(dá)，使前列腺癌細(xì)胞的增殖周期受阻于G1期，抑制細(xì)胞的增殖，從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。 多種方法可以合成分泌高濃度NO，文獻(xiàn)多采用NO供體如硝基擴(kuò)血管藥物，作為模擬體內(nèi)高濃度NO的研究手段，但存在耐藥性差、副反應(yīng)大等缺陷。亦有方

5、案是通過活化淋巴細(xì)胞直接調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答，這一領(lǐng)域的治療主要是依賴IFN-α、β、γ和IL-2，由于特異性不強(qiáng)、毒性大等原因大多沒有廣泛應(yīng)用。正因?yàn)椴捎盟幬颪O供體或細(xì)胞因子刺激產(chǎn)生NO有很多局限性，本研究試圖通過基因轉(zhuǎn)染的方法將外源性iNOS導(dǎo)入雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞DU145中，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)iNOS基因的表達(dá)。在iNOS的作用下，細(xì)胞內(nèi)NO的濃度升高，即建立了細(xì)胞性NO供體，能持續(xù)穩(wěn)定地釋放大量NO，從而干擾細(xì)胞的生長周期，誘導(dǎo)

6、細(xì)胞發(fā)生凋亡。前列腺在解剖位置上的易接近性以及對該病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，使得前列腺癌成為基因治療的研究熱點(diǎn)之一。目前國內(nèi)外尚無報(bào)道將iNOS應(yīng)用于前列腺癌，因此我們在前期研究的基礎(chǔ)上選擇研究本課題，我們希望將iNOS應(yīng)用于前列腺癌基因治療能為臨床有效治療雄激素非依賴型前列腺癌( AIPC)提供一個(gè)新的思路。本課題由三部分組成。 第一章真核表達(dá)載體pReceiver-M29-iNOS(ORF)的擴(kuò)增制備及鑒定 目的：將外源性i

7、NOS基因?qū)肭傲邢侔┘?xì)胞內(nèi)，首先需構(gòu)建其載體。我們將iNOS基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)片段與質(zhì)粒pReceiver-M29連接成重組DNA，擴(kuò)增制備真核表達(dá)載體pReceiver-M29-iNOS(ORF)重組質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切和測序鑒定，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染人雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞株DU145。 方法：先用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和Xho I酶切質(zhì)粒pcDNA3.0-iNOS和pReceiver

8、-M29，瓊脂糖凝膠回收iNOS(ORF)基因片段和線性化質(zhì)粒pReceiver-M29，純化回收產(chǎn)物并連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化制備好的轉(zhuǎn)化態(tài)大腸桿菌DH5α，搖菌擴(kuò)增，堿裂解法抽取質(zhì)粒；將提取質(zhì)粒行酶切鑒定，并進(jìn)行DNA測序分析，結(jié)果與GenBank公布的iNOS cDNA開放閱讀框序列比對，BLAST程序分析。 結(jié)果：擴(kuò)增抽取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切得到預(yù)期的6.1kb的pReceiver-M29載體和

9、3.3kb的iNOS cDNA( ORF)片斷大小相當(dāng)?shù)膬蓚€(gè)條帶；測序所得結(jié)果與GenBank公布的序列比對，BLAST程序分析提示符合度100％，閱讀框架正確。 結(jié)論：擴(kuò)增得到了攜帶有iNOS cDNA開放閱讀框全長序列的真核表達(dá)載體pReceiver-M29-iNOS(ORF)質(zhì)粒，閱讀框架正確。 第二章脂質(zhì)體介導(dǎo)重組iNOS質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和DU145細(xì)胞的培養(yǎng)篩選 目的：在第一階段，我們利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建了

10、iNOS的真核表達(dá)載體，在第二階段，我們將選用雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞DU145細(xì)胞株作為研究和轉(zhuǎn)染的對象，獲得穩(wěn)定表達(dá)iNOS的雄激素非依賴型前列腺癌DU145細(xì)胞陽性克隆，進(jìn)而用于進(jìn)行細(xì)胞的后續(xù)研究。 方法：5％CO2，37℃條件下，DU145細(xì)胞培養(yǎng)于10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。按陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000說明操作，用重組pReceiver-M29-iNOS( ORF)質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒pRece

11、iver-M29轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞，分組A為轉(zhuǎn)染pReceiver-M29-iNOS質(zhì)粒組、B為轉(zhuǎn)染pReceiver-M29空載體組、C為對照Control組?？股谿418以400～700μg/ml篩選壓力篩選2周，第3周挑取細(xì)胞單克隆并在400μg/ml濃度的G418中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增。Trizol法抽提3組細(xì)胞的總RNA，RT-PCR以一步法逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA及PCR反應(yīng)，產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳觀察攝片，片段回收并送測序。倒置、熒光

12、顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染10天后，對照組DU145細(xì)胞全部死亡，14天后轉(zhuǎn)染pReceiver-M29-iNOS質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pReceiver-M29空載體組始呈克隆狀生長，21天挑出單克隆繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增。3組細(xì)胞抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，PCR反應(yīng)，p-actin為內(nèi)參，瓊脂糖凝膠電泳，顯示轉(zhuǎn)染pReceiver-M29-1NOS質(zhì)粒組出現(xiàn)與設(shè)計(jì)片段大小相當(dāng)?shù)臈l帶，而另兩組則無。熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染pRece

13、iver-M29- iNOS質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pReceiver-M29空載體組細(xì)胞可見綠色熒光。 結(jié)論：本部分成功建立了穩(wěn)定表達(dá)iNOS的DU145細(xì)胞陽性克隆。 第三章轉(zhuǎn)染外源性iNOS基因?qū)π奂に胤且蕾囆颓傲邢侔┘?xì)胞DU145的影響 目的：在證實(shí)成功建立了穩(wěn)定表達(dá)iNOS的雄激素非依賴型前列腺癌DU145細(xì)胞陽性克隆并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后，我們將探討轉(zhuǎn)染iNOS基因后，前列腺癌DU145細(xì)胞的生長和增殖、凋亡是否會

14、受到影響。 方法：5％CO2，37℃條件下，轉(zhuǎn)染pReceiver-M29-iNOS質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pReceiver-M29空載體組、對照Control組DU145細(xì)胞培養(yǎng)于10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)；分別用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡；細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法繪制細(xì)胞生長曲線；觀察使用NOS抑制劑對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的影響。 結(jié)果：倒置顯微鏡下觀察，DU145細(xì)胞轉(zhuǎn)染iNOS后生長狀態(tài)變差，形態(tài)學(xué)惡

15、性表型減輕，流式細(xì)胞儀提示轉(zhuǎn)染iNOS組凋亡增加。生長實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染pReceiver-M29-iNOS質(zhì)粒組細(xì)胞生長較兩對照組減慢(P<0.05)，NOS抑制劑可以加快其生長，但差異不具有顯著性(p<0.05)。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染iNOS基因的DU145細(xì)胞能夠分泌高濃度的NO，轉(zhuǎn)染iNOS基因后，能夠誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡，抑制前列腺癌DU145細(xì)胞的生長，為雄激素非依賴型前列腺癌(androgenindependent p

16、rostate cancer，AIPC)的治療開辟一條新的途徑，為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。 抑制前列腺癌DU145細(xì)胞的生長。在腫瘤研究中最簡單的模型就是體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，現(xiàn)代培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)能夠滿足需要。盡管細(xì)胞系的研究工作可以部分闡明腫瘤發(fā)生機(jī)制、生物學(xué)行為等某些腫瘤生物學(xué)性狀的重要信息，但其生長環(huán)境與體內(nèi)不盡相同，且由于選擇性生長等因素，導(dǎo)致其研究結(jié)果具有一定的局限性。因此將iNOS應(yīng)用于前列腺癌仍然有不少問題有待進(jìn)一步探索，