Th17及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在大鼠肝移植急性排斥及耐受中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：盡管免疫抑制劑的臨床廣泛使用，急性排斥反應(yīng)(acute rejection，AcR)仍是肝移植早期失敗的主要原因，因此抑制急性排斥并誘導(dǎo)免疫耐受是解決該難題的最佳方案。近年研究表明，肝臟急性排斥反應(yīng)除與Th1/Th2軸平衡漂移有關(guān)外，還和Th17/Treg軸密切相關(guān)。因此，調(diào)節(jié)Th17向Treg方向偏移，極可能是誘導(dǎo)免疫耐受形成的另一重要機(jī)制。目前，Th17/Treg平衡在腎臟、心臟、胰島及皮膚移植等方面報(bào)道較多，而在肝移植方面較

2、少，且缺乏對(duì)其機(jī)制的深入研究。因此，闡明肝移植急性排斥中Th17/Treg軸何時(shí)失衡、如何失衡以及其關(guān)鍵因子在急性排斥與耐受中充當(dāng)?shù)慕巧哂兄匾饬x。
　　第一部分、近交系大鼠肝移植急性排斥及耐受模型的建立
　　目的:建立近交系大鼠肝移植急性排斥及耐受模型，探討其構(gòu)建技巧及特點(diǎn)。
　　方法:選擇近交系大鼠LEW和BN為建模對(duì)象，采用“改良kamada法”行大鼠原位肝移植，根據(jù)供受體不同分為2組:①REJ組(LEW-B

3、N);②TOL組(BN-LEW)。術(shù)后觀察兩組受體的一般情況及生存時(shí)間，并于術(shù)后第1，3，5，7天獲取肝組織及外周血，生化檢測(cè)肝功能(ALT、AST、TBIL)動(dòng)態(tài)變化，HE染色觀察肝臟病理改變并計(jì)算排斥活動(dòng)系數(shù)(RAI)。
　　結(jié)果:
　　(1) REJ組大鼠術(shù)后逐漸出現(xiàn)皮毛粗糙，精神萎靡，活動(dòng)少，進(jìn)食少，尿色深黃，而TOL組大鼠的一般情況好，進(jìn)食較多，尿色正常;前者大鼠均于13內(nèi)死亡，TOL組大鼠的平均生存時(shí)間(59.6

4、7±7.03天)明顯長(zhǎng)于REJ組(11.32±0.83天)，兩組的差異明顯(P＜0.05);
　　(2)肝功能結(jié)果顯示:術(shù)后第1天，兩組的肝功能無(wú)明顯差異（P＞0.05）;術(shù)后第3天起，REJ組的血清ALT、AST及TBIL增高，于第7天達(dá)峰值。而TOL組無(wú)明顯變化，兩組比較有顯著差異(P＜0.05);
　　(3)術(shù)后3天REJ組肝臟組織出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化:匯管區(qū)見廣泛的炎性浸潤(rùn)（以淋巴細(xì)胞為主，同時(shí)伴單核及中性粒細(xì)胞），

5、膽管及門靜脈明顯受累;肝小葉結(jié)構(gòu)失常伴肝細(xì)胞空泡狀變性，有局灶性出血及壞死;而TOL組組織形態(tài)學(xué)無(wú)明顯改變。比較兩組排斥活性系數(shù)(RAI)，有顯著性差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論:LEW-BN符合急性排斥反應(yīng)的典型特點(diǎn)，并于第7天達(dá)反應(yīng)高峰，該模型可以作為研究肝移植急性排斥反應(yīng)的理想動(dòng)物模型，而BN-LEW術(shù)后未見明顯排斥反應(yīng)，是免疫耐受組合。
　　第二部分、大鼠肝移植急性排斥與耐受中Th17、 Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子的

6、動(dòng)態(tài)變化
　　目的:探討Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子（RORγτ、L-17、L-23、IL-6）和Treg細(xì)胞及相關(guān)因子(FoxP3、IL-10、TGFβ1)在大鼠急性排斥和耐受中的動(dòng)態(tài)變化及其作用。
　　方法:采用“改良kamada法”行大鼠原位肝移植，分為2組:①REJ組(LEW-BN);②TOL組(BN-LEW)。術(shù)后第1，3，5，7天獲取肝組織及外周血，F(xiàn)CM檢測(cè)外周血Th17、Treg細(xì)胞數(shù)量變化，ELISA檢測(cè)血清中

7、Th17相關(guān)因子(IL-17、IL-23、IL-6)及Treg相關(guān)因子(IL-10，TGFβ1)含量，Western blot檢測(cè)肝組織中上述細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)肝組織RORγτ及FoxP3mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　(1) FCM顯示REJ組PBMC中Th17細(xì)胞比例增多，Treg細(xì)胞比例減少，Th17/Treg明顯失衡;而在TOL組，Th17/Treg比例無(wú)顯著變化。
　　(2) RT-PC

8、R表明REJ中RORγt mRNA表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)oxP3mRNA表達(dá)下調(diào);而TOL組則呈相反趨勢(shì)。兩組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
　　(3) Western blot及ELISA證實(shí)急性排斥反應(yīng)時(shí)，肝組織和血清中Th17相關(guān)細(xì)胞因子(IL-17、IL-23及IL-6)表達(dá)上調(diào)，而Treg相關(guān)細(xì)胞因子（IL-10、TGFβ1）表達(dá)下調(diào);耐受組中兩者則呈相反趨勢(shì)。結(jié)論:急性排斥反應(yīng)時(shí)，Th17細(xì)胞數(shù)量增加，其相關(guān)因子（RO

9、Rγτ、IL-17、IL-23、IL-6）表達(dá)上調(diào)，而Treg細(xì)胞減少，其相關(guān)因子(FoxP3、IL-10、TGFβ1)表達(dá)下調(diào);耐受時(shí)則呈相反趨勢(shì)。提示Th17/Treg失衡可能導(dǎo)致了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。
　　第三部分、過(guò)繼轉(zhuǎn)移CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)的影響
　　目的:探討過(guò)繼轉(zhuǎn)移CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)的影響及其機(jī)制。
　　方法:分離供體(LEW)脾淋巴細(xì)

10、胞靜脈注入受體(BN)，獲得免疫源性后分離BN脾臟單個(gè)核細(xì)胞(SPMC)，繼以MACS分選出CD4+CD25+Treg，并證實(shí)其為活性Treg(CD4+CD25+FoxP3+Treg);以“改良Kamada”法建立大鼠肝移植排斥模型后，隨機(jī)分為:過(guò)繼轉(zhuǎn)染組(AT)和非過(guò)繼轉(zhuǎn)染組(NAT)。觀察術(shù)后生存率，于術(shù)后7d獲取肝臟及血液標(biāo)本，觀察肝臟組織病理變化，生化檢測(cè)血清ALT、AST及TBIL變化，Western Blot檢測(cè)肝組織中IL

11、-17、IL-23、IL-10、TGFβ1、IL-4及IFN-γ蛋白表達(dá)水平， ELISA檢測(cè)血清IL-17、IL-23、IL-10、TGFβ1、IL-4及IFN-γ含量。
　　結(jié)果:通過(guò)混合淋巴反應(yīng)及RT-PCR證實(shí)了經(jīng)供體(LEW)脾淋巴細(xì)胞刺激分選的受體(BN) CD4+CD25+Treg為具有活性的Treg，即CD4+CD25+FoxP3+Treg。過(guò)繼轉(zhuǎn)移CD4+CD25+Treg后，能減輕AcR，延長(zhǎng)受體生存時(shí)間;We

12、stern Blot和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示:AT組IL-17、IL-23表達(dá)量低于NAT組(P＜0.05);而IL-10、TGFβ1表達(dá)量卻明顯高于NAT組(P＜0.01)。同NAT組中比較，AT組INF-γ、 IL-4均下調(diào)，且較其他因子含量低(P＜0.05)，表明過(guò)繼轉(zhuǎn)移CD4+CD25+Treg時(shí)，受體鼠體內(nèi)Th1、Th2型免疫反應(yīng)均被抑制，可能與Treg直接抑制CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞增殖有關(guān)。
　　結(jié)論:過(guò)繼轉(zhuǎn)移C