血管生成抑制劑去甲二氫愈創(chuàng)木酸（NDGA）對大鼠胚胎及卵巢功能影響的初步研究.pdf

1、去甲二氫愈創(chuàng)木酸(Nordihydroguaiareticacid，NDGA)是美洲常見灌木L.tridentata中的主要化學(xué)成份，在西南美洲和墨西哥北部地區(qū)的印第安人有用這種植物的莖和葉制成的草藥來治療外傷、解痙、消炎止痛和驅(qū)除寄生蟲的傳統(tǒng)。NDGA也可以人工合成，作為一種強抗氧化劑用于食品防腐。 國內(nèi)外學(xué)者對NDGA進(jìn)行了多年研究，發(fā)現(xiàn)其具有多種生物學(xué)活性，其中最具代表性的是其能抑制脂氧化酶的活性。另外還發(fā)現(xiàn)NDGA能降低

2、Ⅱ型糖尿病模型的大鼠血糖水平、抑制海馬神經(jīng)元中β-淀粉樣蛋白(Aβ)誘導(dǎo)的Ca2+的積聚、抑制泌乳素刺激的酪蛋白的分泌、干擾雌二醇和睪酮與人性激素結(jié)合蛋白(SHBP)的結(jié)合等。目前對NDGA研究得最深入的是其抗腫瘤的作用。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，腫瘤內(nèi)出現(xiàn)新生的毛細(xì)血管是腫瘤獲得進(jìn)一步生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移的必備條件，而NDGA作為血管生成抑制劑(angiogenesisinhibitor)，能通過抑制新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，降低內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2

3、(Flk-1/KDR)的表達(dá)水平來抑制血管生成(angiogenesis)。Wilson等發(fā)現(xiàn)NDGA有誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化的作用，從此將NDGA作為一種癌分化誘導(dǎo)劑的研究進(jìn)入了一個全新領(lǐng)域，國內(nèi)卞修武等近年來也發(fā)現(xiàn)NDGA能有效抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其分化和凋亡，給腫瘤的治療帶來了新的方向。 而在女性生殖系統(tǒng)中，血管生成作用在子宮內(nèi)膜周期性增殖、卵泡的生長、排卵、黃體的發(fā)育及妊娠期子宮內(nèi)膜的蛻膜化形成等過程中都相當(dāng)活躍。

4、這為研究NDGA的抗血管生成作用提供了天然模型。 本研究通過HE染色、免疫組化染色、圖像分析及電化學(xué)發(fā)光免疫分析等方法和手段，采用反復(fù)皮下注射(s.c.)、單劑量皮下注射和宮腔內(nèi)插管灌注NDGA的方式，觀察子宮和卵巢的形態(tài)學(xué)改變和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)及第八因子相關(guān)抗原(FⅧRAg)抗體在蛻膜中的表達(dá)以及性激素水平的變化，探討NDGA作為血管生成抑制劑對SD大鼠卵巢功能和早期胚胎血管生成的影響及

5、其作用機(jī)制。 主要方法和結(jié)果如下：一、NDGA對大鼠卵巢功能的影響選動情周期規(guī)律的雌性大鼠分別隔日皮下注射NDGA和PBS溶液，連續(xù)20天后部分與同種雄鼠合籠交配；部分處死取子宮和卵巢標(biāo)本，作HE染色及PCNA和FⅧRAg抗體免疫組化染色，并檢測注射NDGA前后的血清性激素。結(jié)果：1.NDGA組的雌鼠不能與雄鼠成功交配而懷孕，陰道涂片提示動物處于動情周期中的動情間期； 2.HE染色見NDGA組卵巢中多數(shù)的成熟黃體體積都偏

6、小，閉鎖卵泡增多，子宮內(nèi)膜腺體小而少，與對照組比較非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)； 3.免疫組化染色見子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞PCNA抗體多為弱陽性，與對照組比較有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)；FⅧRAg抗體表達(dá)弱，微血管密度(MVD)計數(shù)低，與對照組比較有顯著性差異(p＜0.05)； 4.NDGA組雌二醇E2分泌呈低水平(p＜0.01)，孕酮P在總體上呈低水平，動情期和動情間期組稍高于

7、動情前期和后期組，與注射前比較有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)；促卵泡素FSH都呈高水平(p＜0.05)；促黃體生成素LH的波動不規(guī)則，與用藥前比較沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異(p＞0.05)。 二、NDGA皮下注射對大鼠早期胚胎血管生成的影響選妊娠第1天(E1)和第7天(E7)的雌鼠按30mg/kg劑量一次皮下注射NDGA和PBS溶液，于E9時取子宮標(biāo)本，觀察胚胎和新生鼠發(fā)育情況，作HE染色及VEGF、PCNA和FⅧRAg抗體免疫

8、組化染色，檢測血清孕酮。結(jié)果：1.對胚胎的影響：E1時注射者，NDGA組妊娠胚胎數(shù)減少，胚胎直徑較小(p＜0.01)。E7注射，胚胎數(shù)目無明顯變化(p＞0.05)，但胚胎直徑較對照組小(p＜0.01)。 2.對新生鼠的影響：NGDA組每窩產(chǎn)崽數(shù)較對照組少(p＜0.05)；而各鼠崽的平均體重與對照組比較無明顯差異(p＞0.05)。 3.血清孕酮含量：NDGA組與PBS組無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。 4.免疫組化染

9、色和圖像分析：NDGA組蛻膜中VEGF和PCNA抗體表達(dá)減弱，陽性染色細(xì)胞區(qū)域的平均光密度(AOD)值和MVD計數(shù)與對照組比都有顯著性差異(p＜0.01)。 三、NDGA宮腔灌注對大鼠早期胚胎血管生成的影響選妊娠E1和E7的雌鼠按30mg/kg劑量一次宮腔插管灌注NDGA和PBS溶液，于E9時取子宮標(biāo)本，觀察胚胎的發(fā)育情況，并于足月時行剖宮產(chǎn)取出胎鼠，觀察胎鼠發(fā)育情況。作HE染色及VEGF、PCNA和FⅧRAg抗體免疫組化染色，

10、檢測血清孕酮。結(jié)果：1.對胚胎的影響：1)E1灌注者，NDGA組和對照組注藥側(cè)胚胎數(shù)目都減少，但二者比較無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)；NDGA側(cè)胚胎的平均直徑明顯小于對側(cè)和對照組的灌注側(cè)，分別比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)； 2)E7灌注NDGA者，注藥側(cè)胚胎數(shù)無明顯減少(p＞0.05)，但胚胎的平均直徑與對照組比較有顯著性差異(p＜0.05)。 3)胚胎直徑上E1灌注NDGA側(cè)與E7比較有顯著性差異(p＜0.0

11、1)。 2.對足月胎鼠的影響：1)E1灌注NDGA者，注藥側(cè)胎鼠數(shù)與對側(cè)比較有顯著性差異(p＜0.05)和對照組灌注側(cè)比較則沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)； 2)E7灌注NDGA者，注藥側(cè)胎鼠數(shù)無明顯減少，與對側(cè)和對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)； 3)E1和E7灌注者，灌注NDGA側(cè)的胎鼠重量與對側(cè)和對照組比都無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。 3.血清孕酮值：NDGA組與PBS組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異

12、(p＞0.05)。 4.免疫組化染色和圖像分析：NDGA組蛻膜中VEGF和PCNA抗體表達(dá)減弱，陽性染色細(xì)胞區(qū)域的AOD值和MVD計數(shù)與對照各組比都有顯著性差異(p＜0.01)。 結(jié)論：1.NDGA能通過抑制卵巢和子宮內(nèi)膜中微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖來抑制血管生成作用，長時間用NDGA可以干擾雌鼠卵巢激素的分泌，使動物的動情周期發(fā)生紊亂； 2.NDGA經(jīng)宮腔灌注和皮下注射都能抑制蛻膜中VEGF的表達(dá)，抑制微血管生成和細(xì)