低溫下心肌細(xì)胞骨架微管的變化與冷缺血損傷相關(guān)性的研究.pdf

1、心臟移植是公認(rèn)的治療終末期心臟病唯一有效的手段，但由于供體心臟的低溫安全保存期目前僅有4～6小時(shí)，極大地限制了心臟移植的開(kāi)展。因此，如何有效地延長(zhǎng)離體心臟安全保存期是心臟移植中亟待解決的問(wèn)題，而闡明心肌冷缺血損傷的病理生理學(xué)機(jī)制，尋找更有效的抗心肌冷缺血/再灌注損傷措施則是一個(gè)重大的研究課題。細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)重要的保守結(jié)構(gòu)，在維持細(xì)胞內(nèi)外的有序性空間結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的生命活動(dòng)中起重要作用。由于細(xì)胞骨架的完整性與溫度有密切關(guān)系，因此，研究低溫環(huán)

2、境下心肌細(xì)胞骨架的變化對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響十分必要。該課題依據(jù)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在細(xì)胞骨架研究方面所取得的新進(jìn)展，從細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的角度出發(fā)，探討低溫環(huán)境下心肌細(xì)胞骨架微管與心肌冷缺血損傷的關(guān)系，以及將保護(hù)細(xì)胞骨架作為新的心肌保護(hù)措施的可能性。該研究對(duì)于解決器官移植中供體心臟的安全保存難題有重要意義。 本研究分三部分進(jìn)行： 第一部分進(jìn)行成年大鼠離體心臟低溫保存和復(fù)溫再灌注實(shí)驗(yàn)，在保存液中加入微管穩(wěn)定劑和解聚劑，經(jīng)過(guò)6小

3、時(shí)低溫保存后，復(fù)溫再灌注，檢測(cè)冠脈漏出液中心肌酶的含量，同時(shí)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，探討微管的解聚與穩(wěn)定對(duì)離體心臟低溫保存的影響。 第二部分，進(jìn)行成年大鼠分離心肌細(xì)胞低溫保存實(shí)驗(yàn)，分別利用組化免疫熒光和生物化學(xué)比色分析的方法，觀察心肌細(xì)胞經(jīng)歷低溫保存后微管的變化和心肌酶釋放率以及心肌細(xì)胞存活率，探討微管的改變與心肌細(xì)胞損傷之間的關(guān)系。 第三部分，觀察微管穩(wěn)定劑對(duì)低溫保存和復(fù)溫再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的影響；進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞骨架與

4、心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、離體鼠心灌流和低溫保存SD大鼠隨機(jī)分成3組，包括對(duì)照組(HTK液保存)，紫杉酚組(HTK液中含紫杉酚，濃度為10-6M)和秋水仙素組(HTK液中含秋水仙素，濃度為10-6 M)。動(dòng)物麻醉，氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，主動(dòng)脈插入灌注管并迅速取下心臟，在37℃恒溫條件下利用離體鼠心Langendorff灌注模式裝置，進(jìn)行常規(guī)逆行恒壓有氧灌注，待心肌血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定后，留取冠脈漏出液，改為

5、經(jīng)主動(dòng)脈灌注不同的心肌保存液，心臟停跳，放入4℃不同保存液中保存6h，復(fù)溫再灌時(shí)留取冠脈漏出液，并切取心肌組織做光鏡和電鏡觀察。 2、成年SD大鼠心肌細(xì)胞分離灌流方式同前，但是分別用有鈣臺(tái)氏液和無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流。再用含Ⅱ型膠原酶和小牛血清白蛋白(BSA)的無(wú)鈣臺(tái)氏液灌注并消化心臟。然后再用KB液沖洗殘酶。灌流過(guò)程持續(xù)充氧飽和。剪碎心室部分，輕輕振蕩，使細(xì)胞分離，然后濾過(guò)、低速離心、傾出上清液(含部分死亡破碎的細(xì)胞)，即得到實(shí)驗(yàn)用細(xì)

6、胞，換KB液保存。 3、分離心肌細(xì)胞處理方法將每一次分離得到的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，各組設(shè)4℃保存0.5h和3h。實(shí)驗(yàn)組添加紫杉酚(最終濃度為10-6M)。分別在相應(yīng)的保存時(shí)間點(diǎn)取出，吸取細(xì)胞懸液涂片，進(jìn)行微管免疫熒光檢測(cè)和臺(tái)盼藍(lán)染色，余下懸液經(jīng)過(guò)高速離心后，移出上清液，做LDH活力分析，沉淀細(xì)胞用同體積的含1％Triton x-100(Sigma)的PBS 37℃下孵育30min后做LDH活力分析。媒介中(釋放出的)

7、和細(xì)胞溶解(保留的)的LDH活力，通過(guò)分光光度計(jì)和試劑盒檢測(cè)出來(lái)。LDH釋放以占總LDH活力(釋放+保留)的百分比表示。 4、免疫熒光染色方法分離的單細(xì)胞涂片，涼干，然后在冷(-20℃)甲醇中固定3min，再用冷丙酮浸濕三次。放入冰箱，4℃保存，第二日做微管免疫熒光檢測(cè)。熒光顯微鏡下觀察拍照，圖像經(jīng)過(guò)Image-ProPlus圖象分析軟件(Media cybernetics公司)分析檢測(cè)。 5、臺(tái)盼藍(lán)染色涂片后用0.1％

8、臺(tái)盼藍(lán)滴染，高倍鏡下(x400)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算拒染的桿形細(xì)胞所占的比率。 6、凋亡檢測(cè)采用Roche公司檢測(cè)試劑盒，運(yùn)用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的熒光素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果判定：TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核呈現(xiàn)紫色或紫黑色，陰性對(duì)照和正常細(xì)胞核呈淡粉色。 7、漏出心肌酶檢測(cè)采用試劑盒對(duì)離體心臟保存前和再灌注后的冠脈漏出液以及分離心肌細(xì)胞低溫保存后釋放出的和細(xì)胞內(nèi)殘留的心肌

9、酶進(jìn)行生物化學(xué)比色分析。 8、光鏡和電鏡觀察對(duì)心臟低溫保存和復(fù)溫再灌注后的心肌進(jìn)行常規(guī)形態(tài)和凋亡觀察。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、分離的成年大鼠心肌細(xì)胞低溫下微管的改變低溫保存30min后，細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)即遭到解聚，表現(xiàn)為免疫熒光減弱，微管結(jié)構(gòu)的連續(xù)性開(kāi)始喪失，變得粗糙，不光滑，微管結(jié)構(gòu)不清晰。對(duì)照組(單純KB液保存)變化明顯突出，保存05.h后微管平均光密度為20.20±1.49，3h后為12.46±1.66；而實(shí)驗(yàn)組(含

10、紫杉酚)變化輕于對(duì)照組，保存0.5h后為25.49±1.52，3h后為20.41±1.52，在相同保存時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較P<0.05。隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，兩組微管熒光逐漸減弱，微管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行性丟失。 2、分離的成年大鼠心肌細(xì)胞低溫下LDH釋放率乳酸脫氫酶(LDH)從保存的心肌細(xì)胞中釋放的情況，在經(jīng)過(guò)不同保存時(shí)間后被檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組(保存液含微管穩(wěn)定劑)低溫保存0.5h后LDH釋放率為51.88％±1.06，3h后為58

11、.87％±1.09，明顯少于對(duì)照組(保存液不含微管穩(wěn)定劑)；對(duì)照組低溫保存0.5h后LDH釋放率為56.44％±1.45，3h后為65.68％±1.37。在相同保存時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較P<0.05。 3、分離的成年大鼠心肌細(xì)胞低溫下心肌細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率是通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色的方法觀測(cè)到的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在低溫保存3h后兩組差距明顯，對(duì)照組細(xì)胞存活率為27.2％±5.05，實(shí)驗(yàn)組為38.80％±2.66。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較P<0.

12、05。 4、成年大鼠心臟低溫保存復(fù)溫再灌注后心肌光鏡下改變對(duì)照組(HTK保存液)心內(nèi)膜下、心肌層、心外膜下均有水腫，表現(xiàn)為細(xì)胞間隙增寬、血管周?chē)g隙增大，心肌細(xì)胞明顯變細(xì)、皺縮，但心肌細(xì)胞邊緣整齊。紫杉酚組與對(duì)照組比較，水腫明顯減輕，心肌細(xì)胞周?chē)g隙變小，心肌細(xì)胞邊緣整齊、形態(tài)基本正常；秋水仙素組心壁各層明顯水腫，心肌細(xì)胞邊緣不整，細(xì)胞周?chē)g隙較大，部分心肌細(xì)胞呈結(jié)節(jié)狀溶解。 5、成年大鼠心臟低溫保存復(fù)溫再灌注后心肌超微

13、結(jié)構(gòu)改變對(duì)照組線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)部分溶解，肌質(zhì)管擴(kuò)張，但肌節(jié)結(jié)構(gòu)仍然清楚，肌絲結(jié)構(gòu)清晰、無(wú)溶解。紫杉酚組無(wú)線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)正常，肌原纖維排列整齊，肌節(jié)各帶清晰可見(jiàn)，肌質(zhì)管擴(kuò)張不明顯。秋水仙素組肌原纖維結(jié)構(gòu)紊亂，肌節(jié)各帶結(jié)構(gòu)不完整，線粒體明顯擴(kuò)張，線粒體嵴溶解、空化現(xiàn)象嚴(yán)重，肌質(zhì)管明顯擴(kuò)張，肌膜腫脹，呈指狀突起。 6、成年大鼠心臟低溫保存復(fù)溫再灌注后冠脈漏出液中心肌酶的檢測(cè)保存后復(fù)灌4min時(shí)各組心肌酶(LDH，GOT,CK)漏

14、出量以秋水仙素組最多，紫杉酚組最少，對(duì)照組次之，三組間差異顯著。 7、成年大鼠心臟低溫保存和復(fù)溫再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生在各對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，電鏡下觀察都可見(jiàn)到心肌細(xì)胞凋亡的核像改變，部分核的染色質(zhì)向核膜集聚，部分核的染色質(zhì)積聚成塊，不均勻分布。 原位末端標(biāo)記(TUNEL法)的切片鏡下觀察可見(jiàn)，發(fā)生凋亡的細(xì)胞主要是心肌細(xì)胞，少數(shù)為浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。組內(nèi)比較和組間比較，結(jié)果：(1)在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，離體鼠心

15、低溫保存時(shí)間與凋亡發(fā)生指數(shù)成正比，低溫保存時(shí)間越長(zhǎng)凋亡細(xì)胞越多(P<0.01)，6h鼠心低溫保存的心肌凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于4h低溫保存的心肌凋亡細(xì)胞數(shù)量； (2)在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，低溫保存時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)復(fù)溫再灌注后的凋亡細(xì)胞發(fā)生影響也越大，凋亡細(xì)胞數(shù)量越多，即6h低溫保存復(fù)溫再灌注后的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于4h低溫保存復(fù)溫再灌注后的心肌凋亡細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)； (3)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組內(nèi)，復(fù)溫再灌注后的凋亡細(xì)胞指數(shù)明顯高于再灌注前的單

16、純低溫保存的凋亡細(xì)胞指數(shù)(P<0.01)，可見(jiàn)復(fù)溫再灌注加重了細(xì)胞損傷，增加了心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量；(4)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，在各個(gè)保存和再灌注時(shí)間點(diǎn)上，凋亡指數(shù)都明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，含有紫杉酚(10-6 M)的供心保存液THK液具有明顯的低溫供心保護(hù)作用。 結(jié)論： 1、4℃低溫下，分離心肌細(xì)胞保存0.5h心肌細(xì)胞微管即發(fā)生解聚，保存3h微管解聚加重，解聚程度與低溫缺血時(shí)間成正比。紫杉酚可以穩(wěn)定微管，減輕微管的解

17、聚。 2、4℃低溫下離體心臟心肌細(xì)胞損傷、心肌酶(LDH,GOT,CK)釋放，與微管解聚成正相關(guān)，穩(wěn)定微管可以減輕心肌細(xì)胞釋放LDH、GOT和CK。 3、4℃低溫下可以導(dǎo)致離體心臟線粒體結(jié)構(gòu)受損，微管解聚劑可以加重線粒體損害，微管穩(wěn)定劑可以減輕這種損害。 4、4℃低溫保存可以引起離體心臟心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生，復(fù)溫再灌注能加重凋亡發(fā)生，低溫保存時(shí)間越長(zhǎng)，復(fù)溫再灌注后心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的越多。微管穩(wěn)定劑可以減輕低溫保存下心