缺血后處理促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的：
　　 心肌細(xì)胞一直被認(rèn)為屬于終末分化細(xì)胞，不具有增殖能力。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞在生理或病理?xiàng)l件下能進(jìn)入細(xì)胞周期而增殖。缺血后處理(ischemicpostconditioning，IPO)對缺血/再灌注損傷保護(hù)作用的信號傳導(dǎo)機(jī)制，不僅能阻止細(xì)胞凋亡，還參與細(xì)胞周期的調(diào)控。提示IPO除了通過抗凋亡保護(hù)心肌外，還可能誘發(fā)細(xì)胞增殖從而修復(fù)損傷。實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠缺血后處理模型，觀察細(xì)胞增殖的特異指標(biāo)，探討IPO是否能誘發(fā)

2、心肌細(xì)胞增殖，為IPO的心肌保護(hù)作用提供新的理論依據(jù)和新思路。
　　 方法：
　　 1.分組和模型的建立。健康成年雄性SD大鼠，體重250～300g。隨機(jī)分為三組，每組6只：①假手術(shù)組(shamoperation，S)：開胸后僅在左冠狀動(dòng)脈前降支(leftanteriordescendingartery,LAD)下穿線，不結(jié)扎。②缺血再灌注組(Ischemia/Reperfusion，I/R):可逆性結(jié)扎LAD造成心肌缺

3、血30min，再灌注。⑨IPO組：可逆性結(jié)扎LAD造成心肌缺血30min，隨即進(jìn)行3個(gè)循環(huán)再灌注10s/缺血10s的處理，再灌注。④缺血成功的標(biāo)志：結(jié)扎后左室前壁變色,局部心肌由紅色變?yōu)榘祷疑琒T段明顯抬高。術(shù)后，觀察各組1d、3d、7d、14d、30d的各項(xiàng)指標(biāo)。
　　 2.心功能的測定。分別記錄各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)各項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dtma

4、x)和左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dtmax)等。
　　 3.HE染色檢查各組心肌組織的形態(tài)學(xué)變化，觀察并比較I/R和IPO對心肌組織的損傷程度。
　　 4.心肌細(xì)胞增殖指標(biāo)的觀察。分別采用免疫熒光雙標(biāo)染色法和免疫組化SABC法兩種方法定位觀察細(xì)胞增殖特異性指標(biāo)：①通過檢測5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)和橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcomericactin，α-SMA)觀察心肌細(xì)

5、胞DNA合成；②利用磷酸化組蛋白H3(phosph-HistoneH3，H3P)和α-SMA檢測心肌細(xì)胞有絲分裂；③利用AuroraB和α-SMA檢測心肌細(xì)胞胞質(zhì)分裂。再通過WesternBlot檢測各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織AuroraB蛋白的表達(dá)量。其目的之一是進(jìn)一步確認(rèn)心肌細(xì)胞的增殖，二是判斷IPO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的時(shí)間趨勢。
　　 結(jié)果：
　　 1.IPO干預(yù)后可以改善大鼠心功能。術(shù)后1d、3d、7d、14d、3

6、0d血流動(dòng)力學(xué)的變化：I/R組和IPO組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯低于S組，同時(shí)LVEDP明顯高于S組。與I/R組比較，IPO干預(yù)后不同時(shí)間LVSP及±dp/dtmax均升高，而LVEDP有下降趨勢。
　　 2.IPO能減輕再灌注對心肌組織的損傷。HE染色結(jié)果顯示，S組心肌細(xì)胞病理學(xué)改變不明顯，肌纖維整齊排列，走行自然；I/R組心肌細(xì)胞排列紊亂、腫脹明顯，炎性細(xì)胞浸潤顯著；IPO組病理學(xué)變化較I/R組

7、減輕，肌纖維排列較整齊，細(xì)胞腫脹減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少。
　　 3.IPO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的觀察結(jié)果：
　　 3.1.免疫組化SABC法定位觀察BrdU、H3P、AuroraB:BrdU、H3P、AuroraB分別染色呈棕黃色為陽性細(xì)胞。結(jié)果顯示，棕黃色陽性目標(biāo)蛋白顆粒在心肌組織呈散在分布，S組陽性細(xì)胞較少，I/R組和IPO組陽性細(xì)胞不同程度增多。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：BrdU、H3P、AuroraB的PU值((x)±s)

8、分別為IPO組(7.81±1.39、5.18±0.47、10.75±0.93);I/R組(5.27±1.35、4.23±0.57、8.95±0.68);S組(4.39±1.22、2.97±1.24、5.31±0.50)。①BrdU:IPO組的PU值與S組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。IPO組與I/R組比較、I/R組與S組比較均在數(shù)值上有提高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②H3P:各組統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與BrdU一致。⑧AuroraB:I/R組、I

9、PO組PU值與S組比較，有顯著性差異(P＜0.01)，IPO組與I/R組的PU值比較，也有明顯差異(P＜0.05)。
　　 3.2.H3P、AuroraB免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示：H3P、AuroraB的陽性細(xì)胞數(shù)((x)±s)分別為lPO組(7.58±1.04、11.23±0.75)、I/R組(5.53±0.64、9.70±0.44)、S組(3.16±0.57、7.76±0.53)。IPO組和I/R組的H3P、AuroraB陽

10、性細(xì)胞數(shù)均高于S組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P＜0.01)，IPO組與I/R組比較也有顯著性差異(P＜0.05)。以上兩種免疫組化方法結(jié)果進(jìn)一步證明H3P、AuroraB在IPO組和I/R組的表達(dá)有不同程度的增加，而且兩種方法結(jié)果一致。H3P采用免疫組化SABC法和免疫熒光雙標(biāo)染色法統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果有區(qū)別，可能與后者方法靈敏度高有關(guān)。
　　 4.WesternBlot結(jié)果顯示，不同時(shí)間各組大鼠AruoraB蛋白表達(dá)為：I/R組和IP

11、O組AuroraB蛋白表達(dá)均較S組明顯升高，并于第3天和第7天分別達(dá)到高峰。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，第3天和第7天AuroraB的蛋白表達(dá)((x)±s)分別為IPO組(1.04±0.19;0.91±0.05)、I/R組(0.73±0.01;0.78±0.02)、S組(0.29±0.04;0.51±0.01)。第3天：IPO組、I/R組和S組比較，有顯著性差異(P＜0.05)，IPO組與I/R組比較，也有顯著性差異(P＜0.05)；第7天：I

12、PO組、I/R組和S組比較，有顯著性差異(P＜0.01)，IPO組與I/R組比較，也有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.IPO能改善心功能，并減輕缺血再灌注對心肌組織的病理學(xué)變化。
　　 2.IPO可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的特異性指標(biāo)BrdU、H3P、AuroraB表達(dá)增加。
　　 3.IPO除能減少細(xì)胞凋亡外，還可以促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖補(bǔ)償受損的心肌細(xì)胞，從而達(dá)到改善心功能、減輕再灌注損傷的