白僵菌硝酸鹽還原酶缺陷型突變體的篩選與鑒定.pdf

1、白僵菌是一種重要的蟲生生防真菌，在害蟲防治中有著廣泛的應(yīng)用，目前其菌種改良的首選方法是基因工程育種，而篩選安全標(biāo)記對獲得工程菌的釋放和推廣有著重要意義。構(gòu)建白僵菌硝酸鹽還原酶缺陷型突變體，以此為轉(zhuǎn)化受體，通過硝酸鹽為唯一氮源篩選轉(zhuǎn)化子，可以避免引入任何外源篩選標(biāo)記，使轉(zhuǎn)基因生物更安全。 本研究采用兩種誘變方法獲得白僵菌不利用硝酸鹽突變體，分別為甲基磺酸乙酯(EMS)誘變原生質(zhì)體和氯酸鹽培養(yǎng)基(WAC)誘變菌絲。EMS誘變原生質(zhì)體

2、方法中對EMS處理濃度和處理時間進行了優(yōu)化，其最佳條件為20μl EMS處理時間為1h至2h；誘變原生質(zhì)體通過富集培養(yǎng)后獲得突變體149株；149株突變體經(jīng)過氮源篩選獲得不利用硝酸鹽突變體88株。88株突變體在硝酸鹽培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)7代后得到穩(wěn)定不利用硝酸鹽突變體(nitl)菌株為68株，穩(wěn)定率為66％～87％之間，屬于nitl； nitl突變體生理表現(xiàn)型為不利用硝酸鹽，利用亞硝酸鹽和次黃嘌呤；穩(wěn)定的突變體硝酸鹽還原酶活性與野生型相比顯

3、著降低，最低為139.13μg/g.h，是野生型菌株硝酸鹽還原酶酶活性的三分之一。同時，EMS誘變獲得的88個突變體中，在10μl EMS處理2h原生質(zhì)體得到4株突變體除不利用硝酸鹽外，完全不利用亞硝酸鹽，利用次黃嘌呤，與前人報道突變體生理表現(xiàn)不一致，為新發(fā)現(xiàn)表型，暫命名為nitX。 WAC方法誘變獲得35株突變體，通過MM培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選到21株不利用硝酸鹽突變體，其生理表現(xiàn)型為不利用硝酸鹽，利用亞硝酸鹽和次黃嘌呤；21株突變

4、體在硝酸鹽培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)7代后共獲得穩(wěn)定不利用硝酸鹽突變體(nitl)菌株19株，穩(wěn)定率達90.47％；穩(wěn)定突變體硝酸鹽還原酶活性為154.47μg/g.h，比野生型菌株降低了226.61μg/g.h。 通過PCR、測序、BLAST及DNAMEN對硝酸還原酶活性最低的穩(wěn)定突變體菌株(編號20-2-17)進行硝酸還原酶基因序列分析。PCR結(jié)果表明野生型和編號20-2-17突變體菌株均擴增出硝酸還原酶基因為0.5kb、2.8kb和

5、3.5kb片段，選擇2.8kb片段測序、BLAST分析表明編號20-2-17突變體硝酸還原酶基因與蟲草白僵菌的硝酸還原酶基因同源性為99％，具有相同的4個保守結(jié)構(gòu)域；與野生型硝酸還原酶氨基酸比對表明：位于保守域中黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)構(gòu)域中695處T(蘇氨酸)突變?yōu)镵(賴氨酸)，位于保守域中次黃嘌呤(NAD)核苷酸結(jié)構(gòu)域中787處S(絲氨酸)變突變?yōu)镃(胱氨酸)，789處A(丙氨酸)變突變?yōu)閂(纈氨酸)。保守區(qū)域蛋白的置換至使硝

6、酸還原酶蛋白組成失活導(dǎo)致其他電子傳遞鏈?zhǔn)艿接绊?，確切原因是次黃嘌呤脫氧化酶(NAD)和黃素腺嘌呤脫氧化酶(FAD)活性失活，進步控制黃素腺嘌呤二核苷酸脫氧化酶(FADH2)和甲基紫酯還原酶活性，造成菌株不能利用硝酸鹽。結(jié)合突變體生理表現(xiàn)與基因序列分析，進一步說明編號20-2-17突變體為不利用硝酸突變體。 本實驗初步建立了球孢白僵菌NR缺陷突變體菌株的誘變、篩選和鑒定方法，為獲得更詳細(xì)的突變體信息，還需要對突變體進行進一步的篩選