杜氏鹽藻硝酸鹽還原酶突變株的篩選和鑒定.pdf

1、開發(fā)鹽藻作為生物反應(yīng)器，可以生產(chǎn)具有藥用價值的蛋白質(zhì)如抗腫瘤藥物血管抑素等。在轉(zhuǎn)基因鹽藻(TransgenicDunaliellasalina)研究中，特別是利用鹽藻生物反應(yīng)器表達(dá)外源基因時，從大量未轉(zhuǎn)化細(xì)胞背景中篩選并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子，必須依賴于有效的選擇標(biāo)記。目前，有關(guān)鹽藻選擇標(biāo)記的研究較少，主要有除草劑、抗生素抗性基因等研究。這些選擇標(biāo)記在利用鹽藻作為生物反應(yīng)器大規(guī)模表達(dá)外源蛋白時具有一定的缺陷：如除草劑本身可能造成一定的環(huán)境污染，

2、除草劑抗性基因可能會經(jīng)自然雜交傳遞至雜草；轉(zhuǎn)基因食品中的抗生素抗性基因可能造成人類對這些抗生素產(chǎn)生抗性等。因此，在鹽藻生物反應(yīng)器的建立過程中，選擇合適的選擇標(biāo)記進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究是迫切而必要的。 植物中的硝酸鹽還原酶(nitratereductase，NR)作為限速酶，催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，這一過程在氮代謝中處于關(guān)鍵地位，對植物生長發(fā)育、產(chǎn)量形成有重要影響。目前已有多種真菌和微藻利用NR基因作為選擇標(biāo)記進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因的研究。與除草

3、劑、抗生素等抗性選擇標(biāo)記相比，NR基因作為選擇標(biāo)記具有下列優(yōu)點：1.遺傳上比較穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率較高；2.篩選簡單：在含硝酸鹽的培養(yǎng)條件下，NR缺陷型突變藻株能夠抗氯酸鹽毒性，而野生藻株不能抗氯酸鹽毒性，因此通過氯酸鹽抗性進(jìn)行篩選，可以較為容易的得到NR缺陷型突變株；3.轉(zhuǎn)化NR缺陷型突變藻株后，非轉(zhuǎn)化株在硝酸鹽培養(yǎng)的條件下不能生長，因此未轉(zhuǎn)化細(xì)胞背景低；4.NR基因為硝酸鹽誘導(dǎo)型基因，便于遺傳操作；5.成本較低，對環(huán)境無污染等。因此在轉(zhuǎn)基

4、因鹽藻研究中，NR基因是更加適合鹽藻自身的、安全的選擇標(biāo)記基因，對今后建立杜氏鹽藻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，使外源目的基因在其中穩(wěn)定表達(dá)、生產(chǎn)目的基因產(chǎn)品具有十分重要的意義。 建立NR基因選擇標(biāo)記是通過克隆NR基因，并將該基因轉(zhuǎn)化NR基因缺陷型突變株，使突變株恢復(fù)野生型NR活性而建立選擇體系。目前，本研究室謝華等已完成杜氏鹽藻NR基因的克隆、鑒定和載體的構(gòu)建工作；賈巖龍等初步建立了杜氏鹽藻NR缺陷型突變體藻株的誘變、篩選和鑒定方法。本論文主

5、要完成杜氏鹽藻NR完全缺陷型突變藻株的篩選和在基因水平上的鑒定工作，為最終利用NR基因建立杜氏鹽藻專用篩選標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。 實驗方法 1.杜氏鹽藻氯酸鹽抗性突變藻株的篩選和分離 1.1乙基亞硝基脲(ENU)誘變杜氏鹽藻 利用化學(xué)誘變劑ENU可引起大量隨機(jī)單堿基突變的機(jī)制，采用低濃度(0.25-0.50mmol/L)、長時間(10d)誘變的方法對生長至對數(shù)生長期的杜氏鹽藻進(jìn)行誘變。實驗設(shè)陰性、陽性對照組和誘變

6、組：陰性對照組為野生型鹽藻，不進(jìn)行ENU誘變，也不進(jìn)行氯酸鹽抗性篩選；陽性對照組鹽藻，不進(jìn)行ENU誘變，但進(jìn)行氯酸鹽抗性篩選。誘變組經(jīng)過誘變之后得到是一個含有各種突變的突變株文庫。 1.2杜氏鹽藻氯酸鹽抗性突變藻株的篩選 利用NR突變株具有氯酸鹽毒性抗性的特點對經(jīng)ENU誘變的鹽藻進(jìn)行液體篩選和培養(yǎng)皿固體篩選。①液體篩選：誘變后的鹽藻在加入終濃度為200mmol/LNaClO3的PKS培養(yǎng)液中篩選培養(yǎng)10d，然后分別改用以

7、2.5mmol/L尿素和5.0mmol/L亞硝酸鈉為氮源的PKS培養(yǎng)液恢復(fù)培養(yǎng)。共進(jìn)行十次液體篩選，隨后進(jìn)行培養(yǎng)皿固體篩選。②培養(yǎng)皿固體篩選：培養(yǎng)皿篩選分兩部分進(jìn)行，培養(yǎng)皿氯酸鹽抗性實驗和不同氮源固體培養(yǎng)基生長實驗。a.培養(yǎng)皿氯酸鹽抗性實驗：將經(jīng)過液體篩選的誘變組鹽藻和野生型鹽藻分別在含100mmol/L的NaCl03固體篩選培養(yǎng)基(PKS培養(yǎng)液+10g/L瓊脂)上劃線篩選。b.不同氮源固體培養(yǎng)基生長實驗：從固體篩選培養(yǎng)基上挑取氯酸鹽抗

8、性突變藻落，分別用以2.5mmol/L尿素和5.0mmol/L亞硝酸鈉為氮源的PKS培養(yǎng)液恢復(fù)并擴(kuò)大培養(yǎng)。隨后將其分別在含相同氮源的PKS固體篩選培養(yǎng)基上劃線。共進(jìn)行十次培養(yǎng)皿固體篩選，最后挑取生長良好的藻落，用含相同氮源的PKS培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)，得到氯酸鹽抗性突變株庫。 1.396孔板培養(yǎng)單細(xì)胞藻株 由于固體培養(yǎng)基上挑出的藻落可能不是來自一個單細(xì)胞，為了得到基因型一致的突變株鹽藻，作者采用96孔板法分離單細(xì)胞藻株。將生長

9、至對數(shù)生長期的氯酸鹽抗性突變株庫鹽藻細(xì)胞計數(shù)，然后稀釋到8個細(xì)胞/3mL，每個庫用一個96孔板，每孔300νL，加入到96孔板培養(yǎng)。等各孔鹽藻細(xì)胞生長至一定程度(各孔轉(zhuǎn)綠)后，改用含各自氮源的PKS培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)。得到各種氯酸鹽抗性突變株單細(xì)胞藻株庫。 2.杜氏鹽藻NR缺陷型突變藻株的分離和驗證 2.1杜氏鹽藻氯酸鹽抗性突變藻株NR活性的測定 按改進(jìn)的對氨基苯磺酸(磺胺)-α-萘基乙烯二胺法，測定所分離的各氯酸鹽

10、抗性突變藻株的NR活性，挑選出NR活性為零的突變株，反復(fù)檢測其NR活性，驗證其NR活性喪失的穩(wěn)定性，將確定NR活性缺失穩(wěn)定的突變藻株擴(kuò)大培養(yǎng)，即為NR缺陷型突變藻株。 2.2杜氏鹽藻NR缺陷型突變株氯酸鹽抗性試驗 分別用含NaClO3濃度梯度200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、800mmol/L、1600mmol/L的PKS培養(yǎng)液培養(yǎng)NR缺陷型突變株，驗證其高濃度氯酸鹽培養(yǎng)液中的氯酸鹽抗性。以野生

11、型和非完全突變株做陽性對照，野生型在不含氯酸鹽的PKS培養(yǎng)液培養(yǎng)作陰性對照。并且用含200mmol/LNaClO3的野生型致死量的固體培養(yǎng)基驗證NR缺陷型突變株的氯酸鹽抗性的穩(wěn)定性。 2.3杜氏鹽藻NR缺陷型突變株不同氮源生長實驗及生長特性實驗 分別以硝酸鹽、亞硝酸鹽為氮源的液體和固體PKS培養(yǎng)基及無氮固體PKS培養(yǎng)基培養(yǎng)NR缺陷型突變株，觀察它們在不同氮源中的生長情況，以野生型為對照。將新接種的鹽藻培養(yǎng)10天，每天觀察

12、其細(xì)胞形態(tài)、活動度及682nm處的吸光度值，與野生型為對照，觀察其生長情況與野生型的區(qū)別。 3.杜氏鹽藻NR缺陷型突變藻株NRcDNA片段的克隆與序列分析 根據(jù)GenBank上登陸的杜氏鹽藻NR的cDNA序列設(shè)計三對PCR引物，利用PCR的方法分三段擴(kuò)增得到了杜氏鹽藻NR缺陷型突變株NR基因全長cDNA片段，將其插入克隆載體pMD-19，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09，經(jīng)氨芐青霉素抗性和藍(lán)白斑試驗篩選陽性克隆，提質(zhì)粒酶切鑒定重組

13、質(zhì)粒。對含有目的插入片段的陽性克隆菌落分別送四家基因公司進(jìn)行基因序列測定，軟件分析測序結(jié)果。 實驗結(jié)果 1.杜氏鹽藻氯酸鹽抗性突變藻株的篩選和分離 1.1杜氏鹽藻的氯酸鹽抗性篩選結(jié)果 鹽藻經(jīng)液體氯酸鹽篩選后，誘變組生長較好，藻液呈綠色；陽性對照組逐漸發(fā)黃、發(fā)白，藻體沉淀聚集，最后分解死亡；而陰性對照組生長良好。經(jīng)過液體篩選的突變鹽藻能夠在含100mmol/L的NaClO3固體篩選培養(yǎng)基(PKS培養(yǎng)液+10

14、g/L瓊脂)上生長出單藻落，且藻落較多，但野生型鹽藻沒有藻落長出。誘變組鹽藻在以硝酸鹽為氮源的固體PKS培養(yǎng)基生長受到明顯抑制，藻落發(fā)黃且細(xì)小呈針尖樣，在以尿素或亞硝酸鹽為氮源的固體PKS培養(yǎng)基上生長較好，呈綠色且藻落較大。而陰性對照組均生長良好。 1.296孔板培養(yǎng)單細(xì)胞藻株結(jié)果 96孔板中的單細(xì)胞藻群生長較慢，30天時有個別孔開始轉(zhuǎn)綠，每個96孔板上的轉(zhuǎn)綠孔數(shù)不等，最少的3孔，最多的31孔，各轉(zhuǎn)綠孔的位置呈隨機(jī)性分布

15、。第50天時開始將各96孔板中轉(zhuǎn)綠孔的鹽藻擴(kuò)大培養(yǎng)。 2.杜氏鹽藻NR缺陷型突變藻株的分離和驗證 2.1杜氏鹽藻氯酸鹽抗性突變藻株NR活性測定結(jié)果 通過初步對各種單細(xì)胞藻株NR活性測定，得到4株NR活性為零的突變株鹽藻，隨后連續(xù)3次NR活性的檢測結(jié)果表明其中3株的NR活性缺失穩(wěn)定。并且在以后的隨機(jī)檢測中這3株突變株也顯示出了穩(wěn)定的NR活性喪失。因此可以認(rèn)為這3株突變株鹽藻即為NR完全缺陷型突變藻株。 2.

16、2杜氏鹽藻NR缺陷型突變株氯酸鹽抗性試驗結(jié)果 NR缺陷型突變株鹽藻在各氯酸鹽梯度的PKS培養(yǎng)液中生長良好，在最高濃度NaClO3(1600mmol/L)中藻液呈綠色，與野生型陰性對照相同。陽性對照組的野生型鹽藻均死亡，而非完全突變株藻液隨氯酸鹽的濃度增加和培養(yǎng)時間的延長而逐漸變黃。 2.3杜氏鹽藻NR缺陷型突變株不同氮源生長實驗及生長特性實驗結(jié)果 NR缺陷型突變株在含亞硝酸鹽的固體和液體培養(yǎng)基上生長良好，在含硝酸

17、鹽的液體培養(yǎng)基中藻液逐漸變黃生長明顯受到抑制，而在含硝酸鹽的固體培養(yǎng)基上未見藻落長出；野生型鹽藻在硝酸鹽和亞硝酸鹽的固體和液體培養(yǎng)基上均生長良好。 結(jié)論： 1.完善了杜氏鹽藻NR缺陷型突變藻株誘變、篩選、分離和鑒定的步驟和程序。 2.通過篩選和鑒定，共得到了3株NR活性完全喪失的突變藻株。序列分析表明，3株突變株共有11處相同的突變，其中的3處點突變引起了氨基酸性質(zhì)的改變。它們均在近3’端有一段相同的移碼突

18、變，造成19個氨基酸的完全改變。此外，2株還分別由于在1235和1639位的點突變而產(chǎn)生了一個終止密碼子。這些序列改變?yōu)樗鼈兊腘R活性的喪失提供了證據(jù)。 3.杜氏鹽藻NR缺陷型突變藻株在硝酸鹽固體培養(yǎng)基上不易生長，可以利用固體培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)化藻株的篩選，即用野生型的杜氏鹽藻NR基因轉(zhuǎn)化NR突變株鹽藻，使其恢復(fù)NR活性而能在以硝酸鹽為氮源的PKS固體培養(yǎng)基中生長，從而建立篩選體系，為最終利用NR基因建立杜氏鹽藻專用篩選標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。