植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶編碼基因的研究.pdf

1、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)具有降解亞硝酸鹽的能力。根據(jù)已知四種類型亞硝酸鹽還原酶蛋白序列的保守序列，利用相關(guān)蛋白分析軟件及生物信息學(xué)工具，查找到植物乳桿菌基因組上的亞硝酸鹽還原酶疑似基因8個(gè)?？寺〕鋈炕蛐蛄?，構(gòu)建表達(dá)載體pET-32a(+)-NiRs。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)表達(dá)菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的目的蛋白，按照GENMED公司細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶總活性檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行酶活測(cè)定。

2、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌體內(nèi)的一未知蛋白hypotheticalprotein(HP)具有顯著降解亞硝酸鹽的能力，其酶活達(dá)到了15.48U/mg(U=μmolnitrite/min)；其中一谷胱甘肽還原酶glutathionereductase(GR)和一氧化還原酶Oxidoreductase(ORD)也有酶活，經(jīng)計(jì)算，其酶活分別為2.49U/mg、3.32U/mg。
　　 通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)，HP、GR、ORD蛋白的高級(jí)

3、結(jié)構(gòu)均含有α螺旋、無規(guī)卷曲、延伸主鏈三種二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中HP蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主，含有α螺旋結(jié)構(gòu)的比例為53.76％；GR蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲為主，含有無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的比例為50.45％；ORD蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)主要也是以無規(guī)卷曲為主，含有無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的比例為51.37％；對(duì)該三種蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，三種目的蛋白均無信號(hào)肽，也沒有跨膜區(qū)，故不是分泌蛋白，通過膜泡分泌到胞外的可能性更小。這與這三種蛋白在細(xì)胞內(nèi)

4、的定位預(yù)測(cè)結(jié)果相符，所以推測(cè)HP蛋白、GR蛋白和ORD蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中。
　　 為了初步探索植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的類型，我們成功制備出了大腸桿菌NrfA多克隆抗體。根據(jù)大腸桿菌亞硝酸鹽還原酶NrfA的ORF序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增的方法獲得了NrfA基因的完整序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入到pET-28a(+)載體中，成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a(+)-NrfA。構(gòu)建好的表達(dá)載體pET-28a(+)-NrfA在大