CS-siCkip-1修飾的功能化種植體的成骨功效及體內(nèi)應用研究.pdf

1、近年來，伴隨著牙種植技術的迅速發(fā)展，種植修復已成為缺牙患者所選擇的主要修復方式之一，臨床種植成功率可達到95％左右。但是，系統(tǒng)性骨疾病（如骨質疏松）患者仍存在骨形成能力弱、骨結合不良等現(xiàn)象，增加了種植失敗的風險。在提高骨質疏松患者種植體骨結合的多種途徑中，種植體的生物功能化被認為是一種極具前景的方法。酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(Ckip-1)參與骨代謝，是成骨細胞分化和骨形成過程中至關重要的負調控因素，通過 RNA干擾技術全身應用Cki

2、p-1siRNA（siCkip-1）對其進行基因沉默，能夠提高骨質疏松條件下的骨形成。因此，采用 siCkip-1對種植體表面進行修飾有望促進種植體表面骨形成，從而提高骨質疏松患者的種植體成功率。
　　本研究首先采用殼聚糖（CS）作為基因載體，通過靜電作用與siCkip-1形成CS/siCkip-1復合物，將該復合物加載于堿熱處理種植體表面，制備得到CS/siCkip-1功能化的種植體，并對該種植體表面進行表面微觀結構和表面性狀分

3、析；然后應用骨髓間充質干細胞，評價 siCkip-1的轉染情況及該細胞在種植體表面的增殖和成骨分化水平；最后將種植體植入骨質疏松大鼠體內(nèi)，初步探索該種植體在骨質疏松條件下早期骨結合能力。通過全面評價 Ckip-1siRNA的作用，證實其在種植體表面應用的可行性，為骨質疏松種植體表面siRNA功能化修飾提供依據(jù)，為功能化種植體的表面設計提供指導。
　　第一部分 CS/siCkip-1功能化種植體的構建及表面性狀分析
　　目的：

4、構建CS/siCkip-1功能化種植體并對其表面性狀進行分析，為后續(xù)體內(nèi)外實驗提供模型。
　　方法：TA-CS/siCkip-1種植體的制備：制備殼聚糖/Ckip-1siRNA（CS/siCkip-1）復合物，馬爾文激光粒度分析儀測量該復合物的粒徑及zeta電位。純鈦種植體（PT）經(jīng)過在NaOH溶液中加熱處理，形成堿熱處理鈦（TA）。將CS/siCkip-1復合物加載在TA表面，制備形成TA-CS/siCkip-1種植體。

5、　　TA-CS/siCkip-1種植體的表面形狀分析：掃描電鏡（SEM）觀察PT、TA和TA-CS/siCkip-1表面微觀形貌。Cy-3標記siCkip-1，激光共聚焦逐層掃描觀察siCkip-1在試樣表面分布情況。接觸角系統(tǒng)獲取液滴圖像并測量各組試樣表面接觸角，評價試樣表面親水性。將試樣浸入BSA蛋白24 h后使用BCA蛋白檢測試劑盒測定試樣表面蛋白吸附水平。
　　結果：殼聚糖和Ckip-1siRNA通過靜電作用結合，形成CS

6、/siCkip-1復合物。該復合物粒徑大小約為235.9±25.6 nm，zeta電位為+13.7±2.77 mV。
　　堿熱處理后形成TA，呈現(xiàn)多孔的纖維網(wǎng)狀結構。CS/siCkip-1復合物能夠均勻的加載在TA種植體表面，還可進入到多孔結構內(nèi)部，形成厚約2000 nm的siCkip-1層。
　　接觸角測量結果顯示，堿熱處理使種植體親水性增加，TA-CS/siCkip-1親水性低于TA組，但明顯高于PT。對各組試樣表面蛋白

7、吸附進行定量，TA-CS/siCkip-1組蛋白吸附量顯著高于PT及TA組。
　　結論：殼聚糖和siCkip-1能夠在靜電作用下形成粒徑分布較一致、呈正電性的CS/siCkip-1復合物。CS/siCkip-1復合物能夠均勻地加載在堿熱處理后的種植體表面，構建出的TA-CS/siCkip-1種植體表現(xiàn)出較高的親水性和蛋白吸附水平。
　　第二部分 CS/siCkip-1功能化種植體對大鼠骨髓間充質干細胞（rBMMSC）生物學行

8、為的影響
　　目的：觀察siCkip-1的細胞轉染情況，評價TA-CS/siCkip-1種植體對rBMMSCs增殖及成骨分化能力的影響。
　　方法：全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞，將細胞接種于TA-CS/siCkip-1表面，培養(yǎng)48 h后激光共聚焦觀察siCkip-1的細胞轉染情況。
　　rBMMSCs接種1、4、7天后CCK-8法檢測拋光組（PT）、堿熱處理組（TA）、堿熱處理-殼聚糖組（TA-CS）、堿

9、熱處理-殼聚糖/siRNA對照組（TA-CS/siNC）和堿熱處理-殼聚糖/siCkip-1組（TA-CS/siCkip-1）試樣表面細胞增殖情況，評價細胞活性。成骨誘導7、14、21天后分別檢測試樣表面堿性磷酸酶（ALP）表達、膠原分泌、細胞外基質（ECM）礦化水平，評價成骨分化能力。
　　結果：培養(yǎng)出rBMMSCs細胞形態(tài)及生長狀態(tài)良好，選擇2-4代細胞進行體外實驗研究。細胞接種48 h后，在殼聚糖的保護和攜帶作用下，幾乎所有

10、的siCkip-1轉染進入rBMMSCs細胞內(nèi)，分布于細胞核的周圍。
　　與PT組相比，TA、TA-CS、TA-CS/siNC和TA-CS/siCkip-1促進了表面rBMMSCs細胞增殖，且這四組試樣表面細胞增殖水平?jīng)]有顯著性差異。siCkip-1在細胞內(nèi)發(fā)揮RNA干擾作用，促進了ALP的表達、膠原分泌和細胞外基質礦化。
　　結論：CS/siCkip-1功能化的種植體表現(xiàn)出良好的細胞生物相容性，siCkip-1能夠高效的轉

11、染入胞，促進rBMMSCs的成骨分化。
　　第三部分 CS/siCkip-1功能化的種植體對骨質疏松大鼠骨結合效應的研究
　　目的：建立大鼠骨質疏松模型，探究TA-CS/siCkip-1種植體植入后對骨質疏松條件下早期骨結合的影響。
　　方法：對雌性SD大鼠行雙側卵巢切除術，術后3個月后micro-CT掃描評價大鼠骨質疏松模型建立情況。
　　將堿熱處理（TA）、堿熱處理-殼聚糖組（TA-CS）、堿熱處理-殼聚糖/

12、siRNA對照組（TA-CS/siNC）和堿熱處理-殼聚糖/siCkip-1組（TA-CS/siCkip-1）植入骨質疏松大鼠雙側股骨。植入后不同時期（4 w、12 w）評價骨結合情況，具體方法如下：新生骨的Micro CT重建分析；組織學染色（VG染色）觀察；骨-種植體界面元素掃描分析；機械力學測定（拔出實驗）。
　　結果：雙側卵巢切除3個月后，Micro CT結果顯示大鼠骨質疏松建立成功。種植體植入4周及12周后骨結合分析結果

13、：Micro CT重建及定量分析可見，各組種植體周圍均有新骨形成，TA-CS/siCkip-1骨量最多且結構致密；組織學VG染色顯示：TA-CS/siCkip-1組新骨連續(xù)，與種植體緊密結合；對骨-種植體界面元素掃描，各組種植體表面新骨的組成結構類似于正常骨，且TA-CS/siCkip-1組骨厚度顯著高于其它組；各組種植體拔出力均隨時間的延長而增大，TA-CS/siCkip-1組在各個時間點最大拔出力和剪切強度均顯著高于其它組。