種植體表面RNAi功能化修飾以及形貌分子機制的系列研究.pdf

1、背景：鈦種植體是目前應用于口腔牙齒缺失較為理想的修復材料。雖然大量的臨床病例證實該技術(shù)成功率較高，然而仍存在由于骨結(jié)合不良造成的失敗案例。因此，如何提高種植體骨結(jié)合能力仍是研究的熱點。利用生物分子進行種植體的表面活化具有生物活性強、生物相容性好等優(yōu)勢，是目前較為常用的手段。其中，利用 RNAi技術(shù)對種植體表面活化具有作用靶向、穩(wěn)定、持久等優(yōu)點，是生物活化中的研究熱點。種植體的表面物理形貌優(yōu)化也具有很強的應用前景，而對于形貌的信號轉(zhuǎn)導機制

2、尚不明確。我們課題組在前期進行了大量的關(guān)于微米坑結(jié)構(gòu)和納米管結(jié)構(gòu)影響成骨分化相關(guān)的分子信號通路進行了初步闡釋，然而尚有諸多問題未得到深入研究。因此，深入探索種植體表面形貌的信號轉(zhuǎn)導機制也是研究的重點方向。
　　為此，本研究共分為兩個部分，第一部分是采用相關(guān)物理化學手段對鈦種植體表面進行RNAi功能化修飾，主要包括簡單吸附、分子自組裝和陰極電沉積等方法；第二部分是研究鈦種植體表面形貌的信號轉(zhuǎn)導，主要從亞細胞結(jié)構(gòu)變化和細胞應激反應角度

3、進行闡釋。本研究旨在尋找更為優(yōu)良的種植體表面修飾技術(shù)，進而提高種植體骨結(jié)合；另一方面，為了更好的闡釋生物材料表面微觀結(jié)構(gòu)對細胞行為影響的本質(zhì)，從而為指導生物材料的表面結(jié)構(gòu)設(shè)計提供理論支持。
　　目的：探索鈦種植體表面 RNAi功能化修飾的可行性和修飾方法；探索siRNA轉(zhuǎn)運與細胞自噬的關(guān)系；闡明鈦種植體表面形貌對細胞器的影響；闡明鈦種植體表面形貌對細胞自噬的影響。
　　方法：
　　第一部分、鈦種植體表面RNAi功能化修

4、飾
　　1.采用微弧氧化、陽極氧化等方法在鈦種植體表面構(gòu)建微米級孔洞和納米管形貌；使用的轉(zhuǎn)運載體主要為殼聚糖；miRNA包括miR-148b和陰性對照；siRNA包括siGFP和siCkip-1等；采用直接混合的方式形成不同的轉(zhuǎn)染復合物。
　　2.利用簡單吸附過程，將殼聚糖/miRNA轉(zhuǎn)染復合物涂布在微弧氧化鈦表面，真空冷凍干燥；分子自組裝過程利用帶正電的殼聚糖/siRNA復合物和帶負電的透明質(zhì)酸交替孵育沉積在光滑鈦表面；陰

5、極電沉積方法將納米管化的鈦種植體連接到負極，使用殼聚糖的鹽酸溶液與siRNA形成復合物作為電解液，石墨做正極，低電壓下進行加載。
　　3.使用掃描電鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦、原子力顯微鏡等手段進行材料表面表征；利用熒光強度定量檢測涂層加載效率和釋放規(guī)律；細胞轉(zhuǎn)染后激光共聚焦觀察轉(zhuǎn)染效率；流式細胞儀和實時定量PCR檢測基因沉默效率；在材料表面進行成骨分化實驗，檢測ALP活性、膠原分泌以及礦化狀況，評估種植體表面促進成骨分化的能力。

6、
　　4.分別使用脂質(zhì)體2000和殼聚糖與siRNA形成lipoplex和polyplex復合物轉(zhuǎn)染H1299細胞，MDC染色和western blot檢測自噬水平變化；在自噬調(diào)節(jié)藥物存在情況下轉(zhuǎn)染細胞，流式細胞儀檢測細胞攝取效率和基因沉默效率；免疫熒光染色觀察細胞內(nèi)siRNA和自噬小體的分布。
　　第二部分、鈦種植體表面形貌的信號轉(zhuǎn)導
　　1.采用酸蝕+陽極氧化、堿熱處理、過氧化氫腐蝕等方法在鈦種植體表面構(gòu)建不同的形

7、貌。
　　2.將成骨細胞系MG63培養(yǎng)在不同形貌材料表面，采用細胞器特異性熒光探針對細胞進行染色，激光共聚焦觀察細胞器的分布狀況；流式細胞儀檢測熒光強度；實時定量PCR和western blot檢測細胞器特異性標識表達；透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)；實時定量PCR檢測PERK通路關(guān)鍵分子表達。
　　3.將成骨細胞系MC3T3-E1培養(yǎng)在不同形貌材料表面，采用MDC方法對細胞進行染色，檢測自噬活性；透射電鏡觀察細胞內(nèi)自噬泡的形成和結(jié)

8、構(gòu)特征；western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達變化；羅丹明標記鬼筆環(huán)肽進行細胞骨架染色；掃描電鏡觀察細胞偽足；鈣離子探針染色胞漿鈣離子濃度；在種植體表面進行成骨誘導分化，干預自噬活性，檢測ALP活性和礦化形成。
　　結(jié)果：
　　第一部分、鈦種植體表面RNAi功能化修飾
　　1.微弧氧化和陽極氧化分別能夠在純鈦種植體表面形成微米級孔洞結(jié)構(gòu)和納米管陣列。
　　2.利用簡單吸附過程能夠?qū)崿F(xiàn)殼聚糖/miRNA復合物

9、在微弧氧化表面的均勻加載，復合物能夠深入微米孔洞內(nèi)部；掃描電鏡下涂層分布均勻；早期涂層中miRNA釋放迅速，隨后釋放緩慢；可以實現(xiàn)大鼠原代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的轉(zhuǎn)染；使用miR-148b后能夠顯著促進其成骨分化；細胞活性維持在80％以上。
　　3.分子自組裝技術(shù)能夠在鈦表面形成多層結(jié)構(gòu)包裹殼聚糖/siRNA復合物；原子力顯微鏡顯示表面粗糙度發(fā)生交替波動；掃描電鏡顯示殼聚糖與透明質(zhì)酸形成嵌合結(jié)構(gòu)；siRNA的加載量隨著層數(shù)的增加而

10、增加；釋放速率緩慢；使用siGFP加載后可持續(xù)的沉默H1299細胞中GFP的表達，細胞相容性良好；使用siCkip-1后能夠顯著促進MG63的成骨分化。
　　4.利用陰極電沉積可迅速的將殼聚糖/siRNA復合物加載到納米管表面；熒光顯微鏡和掃描電鏡顯示隨著電流密度的增加，涂層分布逐漸覆蓋納米管口；在短時間內(nèi)siRNA加載量與加載電壓和加載時間成正比；在不同pH中siRNA釋放模式不同，在酸性環(huán)境中較快，中性和堿性環(huán)境中較慢；加載s

11、iGFP后能夠?qū)崿F(xiàn)靶基因持續(xù)性沉默和細胞高效轉(zhuǎn)染；對細胞粘附和活力無顯著影響；使用siCkip-1后能夠顯著促進細胞成骨分化。
　　5.使用lipoplex和polyplex轉(zhuǎn)染H1299細胞后能夠誘發(fā)mTOR-independent自噬反應；不同自噬調(diào)節(jié)藥物對細胞攝取效率無顯著影響；rapamycin和TG顯著促進siRNA沉默效率，LiBr和3-MA顯著減弱siRNA沉默效率；不同自噬調(diào)節(jié)藥物對細胞內(nèi)游離siRNA的比例產(chǎn)生不

12、同影響，與沉默效率相對應。
　　第二部分、鈦種植體表面形貌的信號轉(zhuǎn)導
　　1.采用酸蝕+陽極氧化、堿熱處理、過氧化氫腐蝕等方法分別能在鈦種植體表面構(gòu)建出微米坑-納米管、納米線、納米孔洞形貌。
　　2.微納米形貌表面MG63細胞器分布和數(shù)量未受到顯著影響；與光滑鈦相比，細胞器特異性標識表達均在第1天時下降，第3天后恢復正常水平；透射電鏡顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴張；PERK通路關(guān)鍵分子表達上調(diào)。
　　3.納米管形貌誘發(fā)MC3T

13、3-E1暫時性、可逆性的自噬反應；形貌誘發(fā)的自噬反應類型屬于mTOR-independent類型；細胞骨架分布在納米管表面鋪展明顯，細胞邊緣絲狀偽足豐富，胞漿內(nèi)鈣離子濃度上升；納米線、納米孔洞均可誘發(fā)類似的自噬反應；納米管結(jié)構(gòu)同時也能夠在Hela和H1299兩種腫瘤細胞系中誘發(fā)自噬反應；應用自噬潮抑制劑后種植體表面成骨細胞ALP活性顯著下調(diào)；細胞在與納米管形貌早期接觸后分離，納米管促進成骨分化的能力仍能夠保持。
　　結(jié)論：