表面修飾煅燒骨的制備及其在體外體內(nèi)的成骨實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 表面礦化修飾煅燒骨的制備及其理化性質(zhì)和生物相容性的研究
　　目的：探討一種新的仿生骨材料表面修飾煅燒牛松質(zhì)骨的制備方法,以提高煅燒牛松質(zhì)骨作為組織工程骨的活性。
　　方法：將制備好的大小一致的煅燒牛松質(zhì)骨隨機分成兩組,分別浸泡在配制好的單倍模擬體液(SBF)和1.5倍 SBF中。每組材料的浸泡時間均為三個時間點分別為7d、14d、21d。浸泡結(jié)束后取出煅燒骨材料烘干,然后

2、每組材料每個時間點取樣噴金,用掃描電鏡(SEM)觀察材料表面形態(tài)并分析材料表面礦化成分。通過比較選出效果最理想的表面修飾煅燒牛松質(zhì)骨材料,研究其孔徑、孔隙率、抗壓和抗折強度等理化性質(zhì),并與未經(jīng)表面修飾的煅燒骨材料進行比較。初步評價其生物相容性。
　　結(jié)果：EM對兩組各個時間點進行表面觀察與分析顯示,浸泡在1.5倍 SBF里面的材料7d后表面可見有散在的類骨磷灰石,14d時表面可見類骨磷灰石層較完整、均一,21d時材料表面類骨磷灰石

3、層凌亂并有裂紋,而浸泡在單倍 SBF的煅燒骨材料在浸泡7d、14d、21d后表面形成的類骨磷灰石均較少。在1.5倍 SBF中浸泡14d后的煅燒骨材料在理化性質(zhì)方面與未經(jīng)表面礦化的煅燒骨未見明顯差別,其生物相容性能良好。
　　結(jié)論：煅燒骨材料在1.5倍模體液中浸泡14d可以獲得最佳表面修飾效果,同時保留了原有煅燒骨材料的基本理化特性,具有良好的生物相容性。
　　第二部分 表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料對小鼠M

4、C3T3-E1粘附、增殖和向成骨方向分化的研究
　　目的：構(gòu)建表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料,評價表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料對小鼠MC3T3-E1細胞的粘附、增殖和誘導(dǎo)成骨分化的影響。
　　方法：對煅燒骨材料進行表面改性以提高煅燒骨支架材料的骨傳導(dǎo)活性與骨誘導(dǎo)活性。將制備好的表面礦化修飾煅燒骨直接與本課題組自主設(shè)計并研制的BMP-2活性多肽(P24)進行復(fù)合,構(gòu)建表面礦化修飾煅燒骨/B

5、MP-2活性多肽仿生骨材料。檢測 P24在表面礦化修飾煅燒骨支架材料中的釋放情況。實驗分三組:A組為表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性多肽材料,B組為表面礦化修飾煅燒骨材料,C組為單純的煅燒骨材料。分別將小鼠MC3T3-E1細胞種植在三種材料表面,測定細胞與材料到粘附率。四甲基偶氮唑藍微量酶反應(yīng)比色法(MTT)和掃描電鏡(SEM)檢測小鼠MC3T3-E1細胞體外增殖活性,同時通過檢測堿性磷酸酶(ALP)活性,ALP染色和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色

6、了解小鼠MC3T3-E1細胞成骨分化情況。
　　結(jié)果：體外緩釋試驗證實 P24在表面礦化修飾煅燒骨表面具有緩慢釋放特性。細胞粘附率,MTT試驗和SEM檢測顯示,小鼠MC3T3-E1細胞在表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料表面的粘附性能和增殖能力明顯高于表面礦化修飾煅燒骨和單純的煅燒骨材料,同時表面礦化修飾煅燒骨材料組高于單純的煅燒骨材料組,組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ALP活性檢測顯示:P24誘導(dǎo)的A組

7、ALP活性明顯高于 B組和C組,B組高于 C組。ALP染色和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色:P24誘導(dǎo)的A組出現(xiàn)陽性表現(xiàn)的時間最早。
　　結(jié)論：表面礦化修飾煅燒骨能促進小鼠MC3T3-E1細胞在骨基質(zhì)材料表面的粘附與增殖并能較好地保持細胞的形態(tài)。表面礦化修飾煅燒骨是活性多肽 P24較理想的一種載體材料,有利于充分發(fā)揮 P24的成骨活性。
　　第三部分 BMP-2活性肽/鼠尾 Ⅰ型膠原復(fù)合物植入異位成骨的實驗研究
　　目的：用動物實驗

8、的方法驗證鼠尾 Ⅰ型膠原支架與自行研制合成的BMP2活性多肽復(fù)合后誘導(dǎo)異位成骨的能力與作用。
　　方法：自行提取鼠尾 Ⅰ型膠原以及與 BMP2活性多肽復(fù)合凍干后低真空模式下電鏡觀察膠原結(jié)構(gòu)。實驗分2組。對照組:單純鼠尾 I型膠原組;實驗組:BMP2活性多肽/鼠尾 Ⅰ型膠原復(fù)合物組。將24只 SD大鼠隨機分成2組,對照組6只,實驗組18只。每只大白鼠右側(cè)大腿作2cm的切口,制備股四頭肌肌袋模型,將上述材料分別植入肌袋。術(shù)后第3,6周

9、分別作放射學(xué)檢查(X-ray,CT),第6周將所有大白鼠處死作組織學(xué)(HE和Von Kossa染色)檢查。
　　結(jié)果：鼠尾 Ⅰ型膠原凍干后孔徑大小合適與 BMP2活性多肽復(fù)合后無明顯改變,是一種較理想的載體。術(shù)后第3,6周放射學(xué)檢查可見實驗組有明顯的鈣化影形成,且第6周成骨范圍要明顯大于第3周時所見,而對照組無成骨現(xiàn)象。術(shù)后第6周組織學(xué)觀察可見實驗組植入?yún)^(qū)有成骨細胞和大量新骨形成,而對照組僅見炎性細胞改變。
　　結(jié)論：鼠尾

10、Ⅰ型膠原是一種較好的載體支架材料,自行研制合成的BMP2活性多肽與其復(fù)合后,具有較強的異位誘導(dǎo)成骨能力。
　　第四部分表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料修復(fù)兔橈骨缺損的實驗研究
　　目的：探討表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料修復(fù)兔橈骨缺損的可行性與療效。
　　方法：取新西蘭大白兔36只,雌雄不限,隨機分成三組,每組12只,建立橈骨中段10mm的臨界大小骨缺損模型。A組,植入表面礦化修飾煅燒

11、骨/BMP-2活性多肽仿生骨材料;B組,植入表面礦化修飾煅燒骨材料;C組,植入單純的煅燒骨材料。三組材料植入前分別行電鏡掃描觀察。術(shù)后未行固定。術(shù)后4、8、12周行 X線觀察與評分,12周時行三維 CT觀察,8、12周行 HE染色與評分,12周時行 Masson染色觀察,比較三組材料修復(fù)骨缺損的能力。
　　結(jié)果：電鏡觀察顯示:三組材料均保留了天然的孔隙結(jié)構(gòu),孔徑大小為200μm～850μm。A組材料可見白色絮狀或纖維狀活性多肽緊貼

12、在礦化修飾煅燒骨孔壁表面, B組材料煅燒骨表面可見一層較完整、均一的類骨磷灰石層形成。X線片觀察顯示,4周時,A組植入材料周圍骨痂較豐富,與宿主骨間界限較模糊,B組植入材料周圍形成骨痂較之為少,C組植入材料與斷端界限清楚,未見明顯骨痂形成。8周時,A組植入材料與宿主骨間界限模糊,可見大量骨痂形成,骨缺損基本消失,材料有不同程度的吸收,B組植入材料周圍骨痂形成較前增多,C組植入材料與斷端界限較模糊。12周時,A組植入材料與宿主骨連接自然,

13、骨痂開始塑形,髓腔有再通現(xiàn)象,B組植入材料與宿主骨愈合欠自然,材料部分吸收,C組植入材料未見明顯吸收,骨缺損界限不清。X線評分顯示術(shù)后4、8、12周時,A組與 B組和C組相比,具有有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0.05)。術(shù)后12周時三維 CT顯示,A組骨缺損基本修復(fù),新生骨與宿主骨未見明顯界限,B組新生骨與宿主骨之間斷端不清,C組骨缺損尚未完全修復(fù)。組織學(xué)觀察,術(shù)后8、12周時 HE染色評分示 A組骨缺損修復(fù)情況要明顯優(yōu)于與 B組和C組,組間具