肺炎衣原體感染的診斷及其應用.pdf

1、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae，Cpn)作為衣原體屬的一種重要的呼吸道病原微生物，自從上個世紀80年代中期正式命名以來得到了研究者們的廣泛重視。所致疾病最常見的是肺炎和支氣管炎，近年來諸多研究表明其與動脈粥樣硬化綜合癥，老年癡呆癥等疾病有關。Cpn分布極其廣泛，大約有50．80％的成人血清可檢出抗體。在我國，與Cpn感染相關的疾病發(fā)生率呈逐年上升趨勢。目前檢測Cpn的多種方法均存在一定的不足之處。因此，我們試通過制

2、備針對Cpn的單克隆抗體(Monoclonal Antibody，McAb)，建立直接免疫熒光法(DirectImmunofluorescence Assay，DIF)，同時應用巢式聚合酶鏈反應(Polymerase ChainReaction，PCR)與核酸雜交(Southem Blotting)方法，檢測人外周血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)中Cpn抗原和核酸。通過對以上檢測

3、結果的比較，較客觀的評定每種方法的特異性和敏感性，以便用于輔助Cpn感染的臨床診斷，分析Cpn感染與疾病的因果關系。 論文第一部分主要內(nèi)容是，以進口Cpn抗原免疫BALB/C小鼠，將免疫的小鼠脾臟細胞與SP2/0細胞融合，并用間接酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunoadSorbent Assay，ELISA)篩選抗體陽性雜交瘤細胞。結果發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟細胞與SP2/0細胞的融合率為61.46％(236/384)。經(jīng)

4、克隆化及篩選后，最終獲得4株穩(wěn)定分泌CpnMcAb的細胞株。雜交瘤細胞接種小鼠后，收集小鼠腹水McAb，經(jīng)純化后用間接ELISA檢測抗體效價，效價高者可達1：10<'6>；免疫瓊脂擴散試驗鑒定McAb為IgG類；微量熒光免疫試驗(Micro-immunofluorescenceAssay,MIF)檢測McAb種屬特異性發(fā)現(xiàn)，與鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci，Cps)出現(xiàn)一定程度的交叉反應，而與沙眼衣原體(Chlamy

5、dia trachomatis，Ct)則無交叉反應，此結果與進口Cpn MeAb一致。Dot-ELISA顯示獲得的單抗與39.5KD克隆表達的重組Cpn主要外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein，MOMP)呈陽性結合反應，為Cpn MOMP特異性McAb。 論文第二部分是以FITC自行標記自制Cpn McAb，其熒光素與蛋白的比值(F/P)為2.28，成功獲得熒光素標記的MeAb。用自制Cpn MeA

6、b與進口CpnMcAb，建立了直接免疫熒光法(DIF)。用DIF同時檢測240份PBMC標本的Cpn抗原，并進行統(tǒng)計處理。結果顯示，兩種McAb檢測結果均陽性的共86份，SPSS軟件分析自制Cpn McAb的特異性和敏感性均與進口McAb具有中等一致性。可用自制McAb替代進E1 McAb檢測Cpn抗原，以輔助Cpn感染的臨床診斷。與進口McAb相比，自制MeAb同樣具有敏感性和特異性，且有方便、價廉的特點。以自制Cpn McAb對動脈

7、粥樣硬化等心血管疾病和某些呼吸道疾病組標本作Cpn抗原檢測，陽性檢出率分別為69.34％(95/137)和72.06％(49/68)，分別與正常對照組進行比較，統(tǒng)計結果證實均具顯著性差異。提示對于動脈粥樣硬化等某些疾病的發(fā)生和發(fā)展，Cpn感染可能是重要的原因之一，但其中的因果關系還有待深入研究。 論文第三部分通過設計Cpn特異性雙引物，建立了巢式PCR檢測方法，并對該方法進行了相關評價，發(fā)現(xiàn)具有很好的特異性和敏感性。在對240份

8、PBMC標本進行核酸擴增檢測中，呈陽性的有74.17％(178/40)，比DIF的陽性檢出率略高，但并無統(tǒng)計學意義。其中，呼吸道疾病PBMC標本中，巢式PCR的陽性檢出率為79.41％(54/68)，心血管疾病PBMC標本的則為75.18％(103/137)。通過Oligo 6.0軟件設計針對巢式PCR第二步擴增產(chǎn)物，設計特異性DIG標記探針，建立了核酸雜交(Southem BloWing)試驗，對24份巢式PCR擴增陽性的標本進行檢測

9、，陽性符合率為100％，更進一步確證巢式PCR擴增的是特異性Cpn核酸。 本課題通過雜交瘤技術制備并獲得了4株穩(wěn)定分泌特異性Cpn McAb的雜交瘤細胞株，經(jīng)鑒定為On MOMP特異性McAb；建立了DIF、巢式PCR及核酸雜交試驗，用這3種方法對臨床標本進行檢測，結果顯示不僅具有良好的相符性，亦具有較好的敏感性和特異性，均可用于輔助Cpn感染的的臨床診斷，尤其是自制McAb還具有方便、價廉的特點；選用心血管和呼吸系統(tǒng)疾病患者的