肺炎嗜衣原體CPAF重組蛋白的表達、純化及其臨床診斷初步應(yīng)用.pdf

1、目的：構(gòu)建肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae, Cpn)蛋白酶樣活性因子（Chlamydial protease–like activity factor，CPAF）免疫優(yōu)勢區(qū) (181～400aa, CPAFm) 基因的重組表達體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，純化表達產(chǎn)物，對其進行免疫活性分析；建立間接ELISA方法檢測Cpn感染臨床標本,評價重組蛋白在臨床診斷中的應(yīng)用價值，為制備Cpn感染快速診斷試劑盒提供實驗

2、依據(jù)。 方法：通過生物信息學(xué)分析并查閱文獻，篩選CPAF免疫優(yōu)勢區(qū)基因，以Cpn CWL029 株基因組DNA為模板，高保真PCR擴增目的基因，將其亞克隆至pGEX6p-2原核表達載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序鑒定后，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達，采用SDS-PAGE和Western blot 分析和鑒定表達產(chǎn)物；復(fù)性后用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）瓊脂糖

3、凝膠FF純化重組蛋白，A280紫外分光光度法測定純化蛋白濃度。用純化的重組蛋白為包被抗原建立間接ELISA方法，優(yōu)化后進行可靠性試驗和穩(wěn)定性試驗，并檢測其與Ct的交叉反應(yīng)。以純化的重組蛋白免疫新西蘭兔，用ELISA方法檢測兔血清中特異性抗體效價，分析重組蛋白的免疫原性；用間接ELISA方法和Western blot分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性。間接ELISA方法與金標準方法MIF檢測臨床標本，評價重組蛋白在血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。以純化的抗

4、重組蛋白多克隆抗體為一抗建立間接ELISA方法，與進口PCR試劑平行檢測呼吸道感染患者痰咽拭子，評價重組蛋白在抗原檢測中的應(yīng)用價值。 結(jié)果：軟件分析CPAF抗原表位并查閱文獻，選擇了CPAF基因第1168241~1167582bp位堿基序列為目的基因（片段長度為660bp，編碼200個氨基酸），PCR擴增得到大小約700bp目的片斷；構(gòu)建的pGEX6p-2/CPAFm重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定證明插入子為目的基因，測序結(jié)果與Gen

5、bank上登錄序列完全一致。SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，重組工程菌表達了一相對分子質(zhì)量（Mr）約51.3 ×103的目的蛋白，在菌體細胞內(nèi)主要以包涵體形式存在，經(jīng)GST瓊脂糖凝膠FF純化得到純度達95％以上的重組蛋白，Western blot檢測其能與Cpn陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。以重組蛋白為包被抗原建立間接ELISA方法，可靠性試驗測得平均批間變異系數(shù)（CV）為 6.52％，平均批內(nèi)CV為8.08％；穩(wěn)定性試驗測得平均

6、批間CV為6.93％；檢測Ct陽性參考血清和臨床陽性血清，無一例交叉反應(yīng)。檢測免疫兔血清中特異性IgG和IgM抗體效價，分別高達1﹕16 000和1﹕8 000以上；檢測Cpn IgG和IgM參考血清，敏感度和特異度均為100％；與MIF試劑同時檢測300份臨床血清標本，IgG和IgM的一致率分別為99.0％和98.3％。以純化的抗重組蛋白多克隆抗體為一抗建立間接ELISA方法，與PCR試劑同時檢測120份病人痰咽拭子中Cpn抗原，一致

7、率為88.3％。 結(jié)論： （1）成功構(gòu)建了pGEX6p-2/CPAFm原核表達重組體，將其轉(zhuǎn)化至E.coli后表達出一相對分子質(zhì)量約51.3 ×103的GST-CPAFm重組蛋白； （2）重組蛋白具有良好的免疫原性，能刺激新西蘭兔產(chǎn)生高效價的特異性IgG 和IgM抗體； （3）重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，能與Cpn陽性血清特異性結(jié)合，可應(yīng)用于Cpn感染血清學(xué)診斷； （4）重組蛋白在Cpn感染血清