家蠶第二白卵近等基因系差異表達基因的研究.pdf

1、隨著家蠶基因組與功能基因研究的逐步深入，家蠶轉(zhuǎn)基因技術在作為鱗翅目模式的基礎科學研究和蠶絲產(chǎn)業(yè)領域的應用需求越來越迫切，家蠶轉(zhuǎn)基因育種技術的研究、開發(fā)利用已經(jīng)成為蠶業(yè)科技界關注的焦點，而轉(zhuǎn)基因陽性個體的高效檢測技術是建立家蠶高效轉(zhuǎn)基因技術的核心之一。 家蠶第二白卵（w-2：10-16.1）性狀個體的卵色和眼色均呈普通遺傳，但目前人們對第二白卵性狀相關的分子機制尚缺乏了解。第二白卵對孵化、生命力、經(jīng)濟性狀等方面的影響都很小，卵及復

2、眼與正常型十分容易區(qū)分，適于作為轉(zhuǎn)基因個體篩選的標記基因。為此，我們通過構建家蠶第二白卵近等基因系，嘗試利用抑制消減雜交技術（suppression subtractive hybridization，SSH）探索卵色性狀形成相關基因的線索，為進一步闡明家蠶第二白卵性狀形成的分子機制、開發(fā)新型轉(zhuǎn)基因標記基因技術提供參考。 本研究取得如下主要進展： 1. 家蠶第二白卵近等基因系構建 以限性黑卵品種蘇卵伴為w-2基因

3、供體，與常用的正常型黑卵品種菁松A雜交，以菁松A為輪回親本進行連續(xù)回交。累代選留經(jīng)w-2基因測交系驗證的雄性雜合個體（＋/w-2）回交菁松A雌性個體（＋/＋）至BC6，全程實行蛾區(qū)育，BC6以后再經(jīng)2代以上同蛾區(qū)交配，獲得純合的第二白卵系統(tǒng)。由此最終建立正常型黑卵品種菁松A（以下簡稱黑卵品系）及其第二白卵近等基因系（菁松A白，以下簡稱白卵品系），其理論純合度達99％以上。 2. 家蠶第二白卵近等基因系轉(zhuǎn)色卵抑制消減雜交及文庫構建

4、 為了獲得正常型黑卵品系相較于第二白卵品系上調(diào)表達的基因信息，選擇以正常型黑卵（菁松）為試驗組（tester），其第二白卵近等基因系為參照組（driver）進行抑制消減雜交，建立了消減雜交文庫。隨機選擇文庫中65個克隆進行序列分析，共獲得65個、37種cDNA序列，長度為107bp－531bp之間。對家蠶基因組和EST數(shù)據(jù)庫進行同源性分析表明，其中30個基因序列為家蠶基因序列，7個序列未能在家蠶基因組發(fā)現(xiàn)同源序列。 在30

5、個家蠶序列中，9個cDNA序列在2個以上克隆中出現(xiàn)，出現(xiàn)頻次占測序總克隆數(shù)的49％，推測這些序列代表了轉(zhuǎn)色卵期正常型黑卵與第二白卵之間表達量差異較大的基因。 3. H46序列cDNA3’末端快速擴增 經(jīng)對家蠶EST數(shù)據(jù)庫進行同源性分析和電子雜交延伸發(fā)現(xiàn)，文庫中高頻次出現(xiàn)克隆H46序列在3’末端有2種以上拼接可能。以菁松A轉(zhuǎn)色期蠶卵的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行H46序列的3’cDNA末端擴增，利用DNAStar軟件包中的

6、EditSeq軟件進行拼接，確認了菁松A轉(zhuǎn)色期蠶卵中該基因的3’末端結(jié)構。 4.基因表達差異的半定量RT-PCR驗證分析 選擇在文庫中2個以上克隆中出現(xiàn)的序列H46和H194作為代表，對黑卵系統(tǒng)和白卵系統(tǒng)轉(zhuǎn)色期蠶卵進行了半定量RT-PCR驗證分析，初步判定H46和H194序列所代表的2個基因在轉(zhuǎn)色期黑卵品系中的表達量均明顯高于白卵品系中的表達量。 5.第二白卵近等基因系間基因表達差異的定量分析 用熒光實時

7、定量RT-PCR技術進行了黑卵品系與白卵品系轉(zhuǎn)色期（卵齡6～36hr）蠶卵H46和H194序列所代表的基因的表達水平比較。H46在黑卵品系轉(zhuǎn)色期蠶卵中的表達量為白卵品系轉(zhuǎn)色期蠶卵的1833倍，差異非常顯著。H194在黑卵品系轉(zhuǎn)色期蠶卵中的表達量為白卵品系轉(zhuǎn)色期蠶卵的36倍，差異明顯。 本實驗建立并利用家蠶第二白卵近等基因系實驗為消減雜交文庫建立的材料，降低了非目標性狀間可能存在的差異造成的假陽性出現(xiàn)概率，在方法學上作了有益嘗試。