辛硫磷誘導(dǎo)下家蠶中腸差異表達基因研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)是重要的經(jīng)濟昆蟲，已有5700多年的飼養(yǎng)歷史。家蠶對農(nóng)藥的抵抗能力較弱，每年由于大田作物治蟲、桑葉的農(nóng)藥殘留造成的大量的家蠶農(nóng)藥中毒，使蠶業(yè)生產(chǎn)遭受了巨大損失。家蠶中腸是食物消化，營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要器官，同時也是抵御外來物質(zhì)的一道天然屏障。作為中腸防御體系的圍食膜具有保護中腸上皮細胞、阻止有害物質(zhì)侵入和幫助消化等多種功能。
　　為了研究農(nóng)藥脅迫下家蠶中腸代謝抗性及損傷機制，本文以家蠶“大造”和“菁松×

2、皓月”為材料，利用基因芯片和高通量測序技術(shù)，研究了家蠶在添食辛硫磷農(nóng)藥后其中腸基因的轉(zhuǎn)錄特征，并通過構(gòu)建家蠶中腸cDNA表達文庫初步篩選了圍食膜蛋白，主要研究結(jié)果如下：
　　1.利用基因芯片技術(shù)分析家蠶中腸經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄特征
　　采用基因芯片技術(shù)，研究了經(jīng)辛硫磷（4.0μg/mL）誘導(dǎo)24h后家蠶中腸差異表達基因，對差異表達基因的功能注釋、分類及涉及的KEGG信號通路進行分析。結(jié)果顯示，經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后中腸中有266個基

3、因顯著差異表達，其中上調(diào)192個，上調(diào)最高達14.88倍，下調(diào)74個，下調(diào)最低是23.36倍。對部分差異表達基因進行分類，篩選出涉及解毒、免疫應(yīng)答、應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝、轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因。采用qRT-PCR技術(shù)對參與代謝解毒、免疫應(yīng)答、應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝和轉(zhuǎn)運相關(guān)的11個基因進行了表達水平的驗證，其中10個基因的表達趨勢和芯片數(shù)據(jù)一致。
　　2.利用高通量測序技術(shù)分析家蠶中腸經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄特征
　　采用高通量測序技術(shù)，研究

4、經(jīng)辛硫磷（4.0μg/mL）誘導(dǎo)24h后家蠶中腸基因表達變化，從解毒、凋亡和免疫防御三個方面分析辛硫磷誘導(dǎo)后對家蠶中腸組織的影響。結(jié)果顯示，添毒后家蠶中腸差異表達基因共254個，其中上調(diào)基因148個，下調(diào)基因106個。解毒酶系中細胞色素P450在解毒過程中可能發(fā)揮重要的作用。通過病理學切片及透射電鏡發(fā)現(xiàn)，辛硫磷農(nóng)藥誘導(dǎo)以后，家蠶中腸發(fā)生凋亡反應(yīng)。采用Western-blotting實驗驗證了細胞色素C從凋亡細胞線粒體中釋放到了細胞質(zhì)中。

5、QRT-PCR結(jié)果表明Toll、IMD信號通路均被抑制。
　　3.家蠶中腸cDNA表達文庫的免疫學篩選
　　本研究成功構(gòu)建了家蠶中腸組織的cDNA表達文庫，初始文庫容量為6.92×106pfu/ml，文庫重組率為92.14%，擴增后文庫滴度達到4.10×109pfu/ml，表明已成功構(gòu)建高質(zhì)量的家蠶中腸cDNA表達文庫。根據(jù)免疫學篩選方法，用制備的家蠶圍食膜蛋白多克隆抗體，對家蠶中腸cDNA表達文庫進行免疫篩選，獲得18個陽