抗Cry1Ac近等基因系小菜蛾類鈣粘蛋白基因片段表達及增效作用研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)由于能夠產(chǎn)生多種對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲具有較好的殺蟲活性的晶體蛋白而被作為殺蟲劑廣泛的應(yīng)用于世界各地。小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)屬于鱗翅目害蟲，是最早發(fā)現(xiàn)的對Bt產(chǎn)生抗藥性的田間種群，廣泛的分布于世界各地。
　　 為了更好的研究小菜蛾的Bt抗性遺傳機理和分子機理，本研究利用高世代回交法和雙親嵌合背景法建立了小菜蛾近等基因系種群RIL

2、-S6，RIL-R6，BC6F4，經(jīng)ISSR種群相似度鑒定，各種群相似度達0.8以上。
　　 利用PCR的方法，合成3對引物擴增出小菜蛾類鈣粘蛋白3個基因片段，經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化構(gòu)建陽性克隆載體。經(jīng)過PCR驗證、質(zhì)粒單酶切雙酶切、測序成功構(gòu)建出了三個融合表達載體分別命名為pET-28a-cadⅠ、pET-28a-cadⅡ、pET-28a-cadⅢ。
　　 對構(gòu)建好的融合表達載體進行IPTG濃度誘導(dǎo)、時間誘導(dǎo)、溫度誘導(dǎo)的表達條

3、件優(yōu)化，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳可知:蛋白表達量最高的誘導(dǎo)條件為25℃，0.1mM/LIPTG濃度誘導(dǎo)36h。
　　 將在不同溫度條件下表達的融合蛋白菌體破碎后的蛋白上清和沉淀SDS-PAGE凝膠電泳可知:在不同的溫度下融合蛋白均以包涵體的形式存在。
　　 對表達的粗蛋白進行生物活性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn):三個片段表達的融合蛋白和2μg/μlCry1Ac毒素混合的殺蟲活性與單獨的三個片段表達的融合蛋白和單獨的2μg/μlCry1