PKM2在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞糖代謝和生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景:膀胱癌是人類(lèi)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均占泌尿系腫瘤首位，其中約90％為尿路上皮癌。近十幾年來(lái)，男性和女性的膀胱癌發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)。雖經(jīng)多年研究，膀胱癌的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制目前仍不明確，因此研究膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于膀胱癌的預(yù)防及治療具有重要意義。
　　腫瘤的特征性代謝改變對(duì)其生長(zhǎng)和增殖具有重要作用。丙酮酸激酶M2亞型(pyruvate kinase M2 isoform，PKM2)催化糖酵解最后一步反

2、應(yīng)，在多種腫瘤中高表達(dá)，且其活性受到多種代謝中間產(chǎn)物和細(xì)胞因子等的調(diào)控，是腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解（Wrburg效應(yīng)）的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。腫瘤可迅速生成能量并累積糖酵解中間代謝產(chǎn)物用于合成代謝，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和增殖。PKM2在腫瘤代謝和生長(zhǎng)中的特殊作用，使其成為腫瘤治療的可能靶點(diǎn)，對(duì)PKM2在膀胱癌中的表達(dá)和功能進(jìn)行研究將有助于闡明相關(guān)機(jī)制和并具有潛在的應(yīng)用前景。
　　目的:(1)檢測(cè)PKM2在膀胱癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)情況，分析PKM2的

3、表達(dá)和膀胱癌臨床病理特征之間的關(guān)系。(2)構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾以特異性的敲低PKM2基因，并經(jīng)藥物篩選構(gòu)建穩(wěn)定敲低PKM2的膀胱癌細(xì)胞株。(3)通過(guò)體外試驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究PKM2基因敲低對(duì)膀胱癌細(xì)胞株糖代謝和生物學(xué)行為的變化。(4)探索PKM2影響人膀胱癌侵襲、轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　方法:(1)收集36例膀胱癌組織及其配對(duì)的癌旁組織，采用Western-blot和實(shí)時(shí)熒光定量-PCR(Quantitative real-ti

4、me polymerasechain reaction，Real-time PCR)及免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)PKM2在膀胱癌組織、配對(duì)癌旁組織及膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)水平與膀胱癌臨床病理特征間的關(guān)系。(2)構(gòu)建靶向PKM2基因的pLV-PKM2-shRNA表達(dá)載體，包裝病毒后感染膀胱癌細(xì)胞株，采用Western-blot和Real-time PCR檢測(cè)shRNA干擾序列對(duì)PKM2表達(dá)的影響，篩選最優(yōu)的shRNA序列進(jìn)入后

5、續(xù)試驗(yàn)。(3)通過(guò)藥物篩選構(gòu)建穩(wěn)定敲低PKM2的膀胱癌細(xì)胞株。通過(guò)葡糖糖、乳酸測(cè)定、CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell試驗(yàn)等方法研究PKM2基因敲低對(duì)膀胱癌細(xì)胞糖代謝、增殖、凋亡、遷移、侵襲等的影響。通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察敲低PKM2對(duì)膀胱癌細(xì)胞株活體成瘤能力的影響。通過(guò)構(gòu)建膀胱癌原位裸鼠模型和活體小動(dòng)物發(fā)光實(shí)驗(yàn)觀察PKM2基因敲低對(duì)膀胱癌成瘤能力及轉(zhuǎn)移的影響。(4)采用Western-blot和Real-time PC

6、R檢測(cè)敲低PKM2后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化，探討PKM2影響膀胱癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:(1) PKM2蛋白和mRNA的表達(dá)水平在膀胱癌組織和細(xì)胞株中明顯增高。PKM2的表達(dá)水平與組織學(xué)分級(jí)和TNM分期正相關(guān)。
　　(2)成功構(gòu)建了3條pLV-PKM2-shRNA和1條pLV-control-shRNA穩(wěn)定表達(dá)的質(zhì)粒。構(gòu)建的3條PKM2-shRNA干擾序列均可顯著敲低T24細(xì)胞PKM2蛋白和mRNA

7、水平的表達(dá)，其中PKM2-shRNA-1的干擾效果最顯著。
　　(3)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低PKM2使T24細(xì)胞的葡萄糖消耗和乳酸生成降低、增值、凋亡、遷移和轉(zhuǎn)移能力下降，ROS生成增加，對(duì)順鉑的敏感性增加。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)提示敲低PKM2后T24細(xì)胞的成瘤重量和成瘤速度降低。原位膀胱成瘤模型提示敲低PKM2后UMUC-3細(xì)胞成瘤能力降低，轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量減少。(4)敲低PKM2后T24的E-cadherin表達(dá)上調(diào)，而Vimentin、