mir-141在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、第一部分miR-141在膀胱尿路上皮癌組織及膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)
　　目的: 研究膀胱尿路上皮癌組織及相關(guān)細(xì)胞株miR-141及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　方法: 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測20例膀胱尿路上皮癌及不同膀胱尿路上皮癌細(xì)胞株miR-141的表達(dá)水平，分析其與膀胱尿路上皮癌臨床參數(shù)的關(guān)系;采用Werstern-blot技術(shù)檢測膀胱尿路上皮癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及相關(guān)細(xì)胞株EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，評(píng)估其EMT狀態(tài)

2、，并分析不同EMT狀態(tài)組織及細(xì)胞株miR-141的表達(dá)情況。
　　結(jié)果: 同正常尿路上皮粘膜及癌旁組織相比，miR-141在尿路上皮癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào);同表淺性膀胱癌相比，miR-141在肌層浸潤性膀胱癌中的表達(dá)則顯著下調(diào);同EMT程度較輕腫的瘤原發(fā)灶相比，miR-141在EMT程度較強(qiáng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)顯著下調(diào);相對(duì)于EMT程度較輕的HTB9及T24細(xì)胞株，miR-141在EMT程度較強(qiáng)的UMUC3細(xì)胞株中表達(dá)水平顯著下

3、調(diào)。
　　結(jié)論: 隨腫瘤分期及分級(jí)的提高，miR-141表達(dá)水平逐漸降低;無論是膀胱尿路上皮癌組織還是細(xì)胞株，隨EMT程度的增加，miR-141的表達(dá)水平均逐漸降低;在尿路上皮癌進(jìn)展過程中，miR-141及EMT相關(guān)蛋白可能都具有重要作用。
　　第二部分pri-mir-141慢病毒載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染膀胱癌UMUC3細(xì)胞株
　　目的: 構(gòu)建miR-141過表達(dá)膀胱癌細(xì)胞株，為進(jìn)一步的體外細(xì)胞研究提供基礎(chǔ)。
　　方

4、法: 將根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)合成的pri-mir-141序列克隆至pLVX-IRES-ZsGreen1構(gòu)建pYr-LVX-pri-mir141表達(dá)質(zhì)粒，并行質(zhì)粒酶切鑒定及測序;將構(gòu)建的miR-141過表達(dá)質(zhì)粒pYr-LVX-pri-mir141及空白對(duì)照質(zhì)粒pLVX-IRES-ZsGreen1分別進(jìn)行慢病毒包裝并測定慢病毒滴度;不同的慢病毒顆粒侵染靶細(xì)胞UMUC3，構(gòu)建miR-141過表達(dá)細(xì)胞株UMUC3-141及空白對(duì)照細(xì)胞株

5、UMUC3-neg，檢測UMUC3、UMUC3-neg及UMUC3-141中miR-141的表達(dá)水平。
　　結(jié)果: 酶切鑒定及測序結(jié)果顯示pYr-LVX-pri-mir141表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;熒光檢測及滴度測定顯示293T細(xì)胞慢病毒包裝成功;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，同UMUC3及UMUC3-neg細(xì)胞相比，UMUC3-141細(xì)胞株miR-141表達(dá)水平顯著提高。
　　結(jié)論: 酶切鑒定及堿基測序比對(duì)結(jié)果表明miR-14

6、1過表達(dá)載體pYr-LVX-pri-mir141構(gòu)建成功;膀胱癌miR-141過表達(dá)細(xì)胞株UMUC3-141及對(duì)照細(xì)胞株UMUC3-neg建立。
　　第三部分過表達(dá)miR-141對(duì)膀胱癌UMUC3細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響
　　目的: 檢測過表達(dá)miR-141對(duì)膀胱癌UMUC3細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響。
　　方法: 分別采用細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)、MTT檢測、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)檢

7、測膀胱癌UMUC3、UMUC3-neg及UMUC3-141細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖、克隆形成及抗凋亡能力。
　　結(jié)果: 細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示:48小時(shí)后，UMUC3-141細(xì)胞的劃痕遷移率較UMUC3及MUC3-neg細(xì)胞顯著降低;Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示:36小時(shí)后，UMUC3-141細(xì)胞的細(xì)胞穿透數(shù)較UMUC3及UMUC3-neg細(xì)胞顯著減少;MTT檢測顯示:UMUC3-141細(xì)胞增殖能力較另外兩組明顯降低;克隆平板克隆形

8、成實(shí)驗(yàn)顯示:三周后UMUC3-141細(xì)胞的克隆形成數(shù)較UMUC3及MUC3-neg細(xì)胞顯著減少;凋亡檢測顯示三組細(xì)胞凋亡率無明顯差異。
　　結(jié)論: miR-141過表達(dá)可以降低膀胱癌UMUC3細(xì)胞株的侵襲、轉(zhuǎn)移及增殖能力，但對(duì)其抗凋亡能力無明顯影響。
　　四部分miR-141與膀胱尿路上皮癌EMT、Wnt信號(hào)通路關(guān)系的初步探討
　　目的: 探討過表達(dá)miR-141對(duì)膀胱癌細(xì)胞株生物學(xué)行為影響的內(nèi)在機(jī)制
　　方法

9、: 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-141可能的靶基因;Western-blot檢測不同miR-141表達(dá)水平下各預(yù)測靶基因的變化，將存在蛋白變化的靶基因作為最終靶基因;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測最終靶基因mRNA表達(dá)水平;檢測不同miR-141細(xì)胞組EMT相關(guān)蛋白及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果: 最終篩選出ZEB2和E3F2蛋白編碼基因?yàn)閙iR-141靶基因;Westem-blot檢測顯示，miR-141表達(dá)水平上調(diào)后，ZEB

10、2及E3F2蛋白表達(dá)下調(diào);EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)上調(diào);Wnt信號(hào)通路下游蛋白CyclinD1及MMP-7表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論: 過表達(dá)miR-141對(duì)膀胱癌細(xì)胞株UMUC3生物學(xué)行為的影響可能與其靶向調(diào)控ZEB2及E2F3有關(guān);過表達(dá)miR-141介導(dǎo)的E-cadherin的表達(dá)上調(diào)不僅通過逆轉(zhuǎn)EMT直接降低了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力;而且導(dǎo)致了WNT/β-catenin信號(hào)通路的抑制，即CylinD1及MMP-7蛋白