HMGB1在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其對(duì)T24細(xì)胞株生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、背景:膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中的常見腫瘤，其中90％的組織學(xué)類型為膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BUC)。盡管經(jīng)過了多年的深入研究和探索，但BUC發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制仍不十分明朗。目前針對(duì)BUC的各種治療手段仍不能讓人完全滿意，BUC患者的總體預(yù)后仍不容樂觀。因此，深入研究探索BUC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)于提高BUC的診療水平和改善BUC患者的預(yù)后具有十分重大的價(jià)值。
　　高遷

2、移率族蛋白1(high-mobility group box1，HMGB1)是一種在真核生物的細(xì)胞中廣泛表達(dá)且高度保守的非組蛋白核蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1與腫瘤的無限增殖，抵抗凋亡，新生血管生成，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于HMGB1在BUC中的表達(dá)研究較少，其對(duì)BUC生物學(xué)行為的影響及其在BUC發(fā)生發(fā)展中所起的作用還不清楚。
　　目的:(1)研究HMGB1在BUC組織

3、及細(xì)胞株中的表達(dá)情況，分析HMGB1的表達(dá)和BUC臨床病理因素之間的關(guān)系。(2)探索構(gòu)建靶向HMGB1的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人BUC細(xì)胞株T24來特異性的沉默HMGB1基因的表達(dá)。(3)研究shRNA介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)T24細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響及T24細(xì)胞生物學(xué)活性的變化。(4)初步研究HMGB1影響人BUC細(xì)胞生物學(xué)行為可能的下游作用機(jī)制。
　　方法:(1)收集30例B

4、UC組織及其配對(duì)的癌旁組織，采用Western-blot和實(shí)時(shí)熒光定量-PCR(real-time polymerase chainreaction，Real-time PCR)分析BUC組織和細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)水平，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)HMGB1蛋白的表達(dá)程度和定位，分析其表達(dá)水平和BUC臨床病理因素之間的關(guān)系。(2)探索構(gòu)建靶向HMGB1基因的pGPU6/GFP/Neo-

5、shRNA表達(dá)載體并采用脂質(zhì)體lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞來特異性的沉默HMGB1的表達(dá)，采用Western-blot和Real-time PCR檢測(cè)shRNA干擾序列對(duì)HMGB1表達(dá)的影響。(3)采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)研究pGPU6/GFP/Neo-HMGB1 shRNA-539表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和細(xì)胞周期的變化。(4)采用Western-blot和Real

6、-time PCR檢測(cè)HMGB1干擾序列轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B/p65，NF-κB/p65)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)的表達(dá)水平，同時(shí)采用間接免疫熒光法(indirectimmunofluorescence)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay，

7、ELISA)來分別檢測(cè)NF-κB/p65在細(xì)胞內(nèi)的定位情況和活性變化。
　　結(jié)果:(1) HMGB1在BUC組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平顯著高于配對(duì)的癌旁組織;IHC結(jié)果顯示HMGB1的陽性染色顆粒絕大部分位于細(xì)胞核，少部分位于細(xì)胞漿;結(jié)合患者的臨床病理資料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)HMGB1的表達(dá)水平與患者的組織學(xué)分級(jí)和TNM分期呈正相關(guān);同時(shí)，HMGB1在5637、BIU-87和T24細(xì)胞中的表達(dá)水平逐次升高，與BUC細(xì)胞的惡性程度相關(guān)。(2)

8、實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建了特異性干擾HMGB1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞;經(jīng)檢測(cè)3條shRNA均可以特異性的抑制HMGB1的表達(dá)，其中以HMGB1 shRNA-539抑制效率最高。(3)特異性的干擾HMGB1基因的表達(dá)能在體外抑制T24細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期遲滯和細(xì)胞凋亡。(4) HMGB1干擾序列轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后NF-κB/p65和VEGF-C的表達(dá)水平下調(diào);同時(shí)NF-κ

9、B/p65的核轉(zhuǎn)位減少活性降低。
　　結(jié)論:(1) HMGB1的表達(dá)水平在BUC組織和細(xì)胞中明顯增高，且與BUC的組織學(xué)分級(jí)和TNM分期正相關(guān)，HMGB1可能與BUC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。(2)特異性的下調(diào)T24細(xì)胞HMGB1的表達(dá)可以顯著抑制其增殖、遷移、侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期遲滯和細(xì)胞凋亡，HMGB1可以作為BUC基因治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。(3)特異性的下調(diào)T24細(xì)胞HMGB1基因的表達(dá)可以引起細(xì)胞中NF-κB/p65