miRNA-182對成年大鼠藥物性聾損傷的保護及機制.pdf

1、實驗一硫酸卡那霉素聯(lián)合呋塞米注射液快速致聾動物模型的建立
　　目的：
　　通過建立快速藥物性聾動物模型,觀察硫酸卡那霉素與呋塞米注射液聯(lián)合用藥對正常SD(Sprague-Dawley)大鼠的聽力學(xué)及形態(tài)學(xué)的影響。
　　方法：
　　32只雌性大鼠腹腔注射硫酸卡那霉素(500mg/Kg),30分鐘后再經(jīng)腹腔注射呋塞米注射液(0.2ml/Kg),正常對照組經(jīng)腹腔注射給予等量生理鹽水。各組實驗動物分別于給藥后1天、7天、

2、14天行腦干誘發(fā)電位(auditory brainstem response,ABR)檢測,并別行基底膜鋪片、免疫熒光染色,掃描電鏡觀察。
　　結(jié)果：
　　聯(lián)合注射呋塞米與硫酸卡那霉素后,藥物致聾組大鼠ABR閾值明顯提高,對照組ABR均正常;鋪片觀察發(fā)現(xiàn)外毛細胞有部分缺失,其中以底轉(zhuǎn)缺失較為明顯,內(nèi)毛細胞損傷程度較輕。
　　結(jié)論：
　　該藥物濃度及給藥方法引起的形態(tài)學(xué)改變,以底轉(zhuǎn)外毛細胞部分缺失為主,但底轉(zhuǎn)并不會

3、完全缺失。與單純給予硫酸卡那霉素或慶大霉素給藥造聾相比,可明顯縮短給藥致聾的時間,且更安全、有效,為耳蝸毛細胞損傷的保護等實驗研究提供了一種簡單、快速而有效的大鼠耳聾的動物模型。
　　實驗二miRNA-182圓窗龕給藥的觀察研究
　　目的：
　　了解miRNA-182及其稀釋劑RNase-free water經(jīng)圓窗給藥在耳蝸內(nèi)的分布及其對毛細胞的影響。
　　方法：
　　24只雌性SD大鼠分為三組,每組8只。

4、即:A組:miRNA-182(帶cy3熒光標記)組、B組:單純RNase-free water組、C組:單純手術(shù)組。每只實驗動物雙耳均行手術(shù)。術(shù)中每組給予對應(yīng)處理,給藥劑量及方式均相同。各組實驗動物于手術(shù)后12小時、24小時及48小時完善ABR檢測,術(shù)后24小時行掃描電鏡檢查,術(shù)后48小時行基底膜鋪片,并分別于術(shù)后24、48小時各留取miRNA-182組一只耳蝸行冰凍切片。
　　結(jié)果：
　　單因素方差分析可知,三組實驗動物給

5、藥致聾后各時間點ABR的反應(yīng)閾值及各組手術(shù)前后ABR閾移均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。各組基底膜鋪片及掃描電鏡均形態(tài)正常,無缺失。根據(jù)耳蝸冰凍切片可知,miRNA-182組術(shù)后24小時的miRNA-182在耳蝸血管紋、corti器上分布較術(shù)后48小時更為顯著。
　　結(jié)論：
　　經(jīng)圓窗龕給予miRNA-182于術(shù)后24小時在耳蝸血管紋及 corti器上分布較48小時更為顯著,且對大鼠聽力學(xué)及形態(tài)學(xué)無損傷作用。
　　實驗

6、三miRNA-182對大鼠藥物性聾損傷的保護作用及其機制
　　目的：
　　研究miRNA-182對大鼠藥物性聾損傷的保護作用。
　　方法：
　　24只雌性SD大鼠隨機分為三組,每組8只。即:A組:miRNA-182組、B組:溶媒劑(RNase-free water)組、C組:空白對照組。A、B兩組經(jīng)圓窗分別給予miRNA-182及RNase-free water,術(shù)后24小時,以上三組實驗動物均完善腦干誘發(fā)電位(

7、ABR)檢測,檢測結(jié)束后當天將以上三組實驗動物按公斤體重先給予硫酸卡那霉素500mg/Kg,腹腔注射一次,30-45分鐘后給予呋塞米注射液0.2ml/Kg,腹腔注射一次。各組實驗動物分別于給藥致聾后1天、7天、14天行ABR檢測,并于第14天最后一次ABR檢測結(jié)束后當天各組均隨機各抽取1只實驗動物,行掃描電鏡檢查、全耳蝸基底膜鋪片、顳骨冰凍切片及免疫熒光染色,另取2只行毛細胞缺失率計數(shù)。
　　結(jié)果：
　　ABR結(jié)果顯示,空白

8、對照組及溶媒劑組在給藥致聾后的各時間點的閾值比較無顯著性差異(P>0.05);空白對照組與溶媒劑組兩者比較,各時間點也無顯著性差異(P>0.05);miRNA-182組與空白對照組、miRNA-182組與溶媒劑組兩者之間比較各時間點均有顯著性差異(P<0.05);miRNA-182組給藥致聾后的各時間點的閾值比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　同時,miRNA-182組與空白對照組、miRNA-182組與溶媒劑組相比,前者與后

9、者給藥致聾前后各時間點的ABR閾移有顯著性差異(P<0.05);溶媒劑組與空白對照組相比,兩組給藥致聾前后各時間點的ABR閾移無顯著性差異(P>0.05)。
　　各組掃描電鏡及基底膜鋪片可見,空白對照組與溶媒組各排外毛細胞纖毛排列紊亂交錯,倒伏明顯,各排均有大量外毛細胞缺失,排列稀疏;miRNA-182組外毛細胞排列紊亂,毛細胞有部分缺失,但缺失較其他兩組明顯較少。miRNA-182組基底膜外毛細胞總?cè)笔蕿?1.57％;溶媒劑組

10、外毛細胞總?cè)笔蕿?0.47%;空白對照組外毛細胞總?cè)笔蕿?7.06%。
　　cleaved caspase-3免疫熒光染色可見,1.miRNA-182組中cleaved caspase-3的表達較正常大鼠增加。2.溶媒劑組及對照組(單純給予硫酸卡那霉素+呋塞米注射液)中cleaved caspase-3的表達量較miRNA-182組及正常大鼠明顯增強。3.溶媒劑組與對照組(單純給予硫酸卡那霉素+呋塞米注射液)兩者之間cleav