腎絡通對梗阻性腎病大鼠氧化應激和細胞凋亡的影響.pdf

1、梗阻性腎病是因尿液排出障礙引發(fā)的腎臟結構和功能損傷的泌尿外科常見疾病，其典型病理改變?yōu)檠仔约毎?、細胞增殖與凋亡、膠原成分異常沉積及腎間質纖維化。目前臨床上對梗阻性腎病的治療主要為解除梗阻，恢復尿路通暢，但是很多患者在梗阻因素解除后腎功能仍不能恢復，甚至繼續(xù)惡化，因此，研究梗阻性腎病的發(fā)病機制可為臨床治療提供理論依據(jù)。最近的研究表明，梗阻性腎病與氧自由基引起的氧化應激和腎小管上皮細胞凋亡有密切聯(lián)系。梗阻造成腎積水繼而腎盂內(nèi)壓力升高，引

2、發(fā)腎臟血流動力學改變。腎小管血供減少誘發(fā)腎小管上皮細胞缺血缺氧性壞死和細胞凋亡，同時缺氧導致大量氧自由基釋放，進一步加重腎小管上皮細胞的氧化損傷;腎血流量的減少還可導致腎小球濾過率下降和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone，RAAS)激活，該系統(tǒng)激活后產(chǎn)生大量氧自由基和核因子-κB(Nuclear factor-κ B，NF-κ B)，誘導促凋亡信號釋放，導致腎小管上皮細胞凋亡。實驗研

3、究證實應用抗氧化藥物可減輕腎臟氧化損傷、抑制腎小管上皮細胞凋亡，改善腎臟功能，說明氧化應激可能參與了細胞凋亡進程。此外，梗阻介導的缺血性氧化損傷誘發(fā)腎小管上皮細胞凋亡可能與多種促凋亡通路密切相關。本次實驗針對UUO(Unilateral ureteral obstruction單側輸尿管結扎)模型中氧化應激與細胞凋亡可能相關機制，給予特異性抗氧化劑Tempol治療，同時給予化瘀通絡方腎絡通，觀察MDA、8-OhdG、8-iso-PGF2

4、α等氧化損傷指標及Caspase-12、caspase-9、Bcl-2、Bax等凋亡相關因子的表達，初步探討中藥對梗阻性腎病大鼠氧化應激和細胞凋亡的保護作用及作用機制。
　　第一部分腎絡通對梗阻性腎病大鼠氧化損傷和腎臟組織病理形態(tài)學的影響
　　方法:實驗動物自由進食和飲水，溫度條件控制在（22±2）℃。適應性飼養(yǎng)1WK后，48只Wistar大鼠隨機分為假手術組（Sham group）、UUO組(UUO group)、Temp

5、ol組(Tempol group)、腎絡通組(SLT group)，每組12只。各組大鼠10％水合氯醛注射后，于左側中腹部切開皮膚，游離左側輸尿管，分別在輸尿管上1/3處和中1/3處用絲線結扎，切斷輸尿管，逐層縫合皮膚。假手術組僅將輸尿管游離但不結扎離斷。術后第10天腎臟明顯腫大，輸尿管擴張，腎盂明顯積水，模型復制成功。術后開始給藥，Tempol組以Tempol30 mg/(kg·d)入水瓶（避光）自由飲用;腎絡通組給予腎絡通煎劑26

6、g/(kg·d)入水瓶飲用，假手術組及UUO組給予等容量生理鹽水飲用，均每天1次。實驗動物入代謝籠收集尿液，備檢。連續(xù)干預10天。10天后，各組大鼠稱重后斷頭處死，留取血液標本，備檢;切取梗阻側腎臟，除去被膜后稱重，部分腎組織置于4％多聚甲醛固定，行HE、Masson染色。
　　采用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA

7、檢驗，組間比較采用LSD-t檢驗。所有假設檢驗方法均以0.05和0.01為顯著性水平標準。
　　結果:
　　1、各組大鼠腎組織病理形態(tài)學改變
　　HE染色顯示，假手術組有少量炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞排列整齊;UUO組腎間質大量炎性細胞浸潤，腎小管明顯擴張，上皮細胞變性、濁腫、壞死、脫落;Tempol組及腎絡通組亦可見腎小管擴張及上皮細胞變性壞死等，但炎性細胞浸潤明顯減少。Masson染色顯示，假手術組可見少量膠原成

8、分表達，主要位于腎小球/腎小管基底膜及腎間質;UUO組腎臟結構紊亂，膠原成分顯著增多，以腎間質為主;Tempol組及腎絡通組膠原纖維表達較假手術組增多，但與UUO組相比則明顯減少。PAS染色顯示，UUO組腎小球基底膜明顯增厚，腎小球內(nèi)糖原沉積增多，腎間質大量炎性細胞浸潤，腎小管部分萎縮，管腔閉塞或擴張，腎間質變寬。假手術組無上述改變，Tempol組及腎絡通組腎小球糖原沉積減少，可見或多或少炎性細胞浸潤，腎小球基底膜輕度增厚，腎小管擴張，

9、但較UUO組減輕。
　　2、各組大鼠血清MDA和血清、尿液8-OhdG及8-iso-PGF2α水平比較
　　與假手術組比較，UUO組血清MDA和血清、尿液8-OHdG含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.05);與UUO組比較，Tempol組及腎絡通組血清MDA和血清、尿液8-OhdG含量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.05)。
　　與假手術組比較，UUO組尿液8-iso-PGF2α含量

10、明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;與UUO組比較，Tempol組及腎絡通組尿液8-iso-PGF2α含量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與假手術組比較，UUO組血清8-iso-PGF2α含量有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與UUO組比較，Tempol組及腎絡通組尿液8-iso-PGF2α含量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　第二部分腎絡通對梗阻性腎病大鼠細胞凋亡的影響
　

11、　方法:動物分組、模型復制、給藥方法同第一部分，共10天。實驗結束時留取腎臟標本，部分腎組織置于4％多聚甲醛固定，用于光鏡和TUNEL檢測細胞凋亡。統(tǒng)計學方法同第一部分。
　　結果:
　　1、光鏡觀察腎臟細胞凋亡
　　1000倍油鏡下可觀察到UUO組大鼠腎臟細胞凋亡，細胞核染成紫藍色，細胞核形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為核濃縮、核裂解。
　　2、TUNEL法檢測腎臟細胞凋亡
　　假手術組可見少量陽性細胞，UUO組陽性

12、凋亡細胞顯著增多(P＜0.01);與UUO組比較，Tempol組及腎絡通組陽性細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），其中Tempol組下降稍明顯，但與腎絡通組比較無統(tǒng)計學意義。
　　第三部分腎絡通對梗阻性腎病大鼠細胞凋亡Caspase通路的影響
　　方法:動物分組、模型復制、給藥方法同第一部分，共10天。實驗結束時切取梗阻側腎臟，部分腎組織4％多聚甲醛固定用于免疫組化，部分腎組織-70℃保存用于提取蛋白。統(tǒng)計學方法同第一部分。

13、r>　　結果:
　　1、免疫組化檢測Caspase12、Caspase9的表達
　　假手術組caspase12呈弱表達;UUO組表達明顯增強，其中以髓質擴張的腎小管上皮細胞胞漿表達最為顯著;Tempol組及腎絡通組亦可見到陽性表達，呈局部中度表達，但較UUO組明顯減弱。
　　假手術組caspase9呈弱表達，主要表達于腎小管上皮細胞胞漿;UUO組表達明顯增強，主要表達于腎小管上皮細胞胞漿，部分附著于細胞膜，呈棕黃色或棕

14、褐色顆粒;Tempol組及腎絡通組亦可見Caspase9陽性表達，較假手術組為甚，但與UUO組比較則明顯減輕。
　　2、Western Blot檢測Caspase12、Caspase9蛋白表達
　　與假手術組比較，UUO組caspase12，caspase9蛋白表達明顯上調;與UUO組比較，Tempol組及腎絡通組其表達均被下調;與Tempol組相比，腎絡通組caspase9未見明顯差異，但caspase12有顯著性差異。<

15、br>　　第四部分腎絡通對梗阻性腎病大鼠細胞凋亡因子Bcl-2、BaX表達的影響
　　方法:動物分組、模型復制、給藥方法同第一部分，共10天。實驗結束時切取梗阻側腎臟，部分腎組織4％多聚甲醛固定用于免疫組化，部分腎組織-70℃保存用于提取mRNA及蛋白。統(tǒng)計學方法同第一部分。
　　結果:
　　1、Real-time PCR檢測Bcl-2、Bax及Bax/Bcl-2 mRNA表達
　　與假手術組比較，UUO組中Ba

16、x及Bax/Bcl-2 mRNA表達上調，Bcl-2mRNA表達下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與UUO組比較，Tempol組及腎絡通組Bax及Bax/Bcl-2 mRNA表達顯著下調，而Bcl-2 mRNA表達上調，其中以Tempol組作用更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　2、免疫組化檢測腎組織Bcl-2、Bax表達
　　假手術組可見Bcl-2陽性表達，主要表達于腎小管和皮髓交界處，腎間質也可見少量

17、表達，呈棕黃色或棕褐色顆粒;UUO組其表達明顯下降，主要表達于近曲小管;與UUO組比較，Tempol組及腎絡通組Bcl-2表達明顯增強。
　　假手術組可見Bax陽性表達，主要表達于腎小管上皮細胞胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒;與假手術組比較，UUO組其表達明顯增強，主要表達于腎小管上皮細胞胞漿;與UUO組比較，Tempol組及腎絡通組Bax表達明顯下降。
　　3、Western Blot檢測腎組織Bcl-2、Bax蛋白表達

18、>　　與假手術組比較，UUO組大鼠Bax表達上調，Bcl-2表達下調，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與UUO組比較，Tempol組及腎絡通組大鼠Bax表達顯著下調，而Bcl-2表達上調，其中以Tempol組作用更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.05)。
　　結論:
　　1、采用單側輸尿管結扎復制梗阻性腎病腎間質纖維化動物模型，腎臟病理顯示大量炎性細胞浸潤、輸尿管擴張明顯及膠原成分大量沉積。腎絡通可改善UU

19、O大鼠腎組織間質纖維化病理損傷程度。
　　2、腎絡通可下調MDA、8-OhdG、8-iso-PGF2α等氧化損傷指標的表達，改善UUO大鼠氧化應激狀態(tài)，起到一定的抗氧化損傷的作用。
　　3、腎絡通可以通過抑制腎臟固有細胞過度凋亡，維持細胞凋亡和增殖之間的動態(tài)平衡，從而減輕UUO誘導的腎臟損傷，起到腎臟保護作用。
　　4、氧化應激通過激活Caspase家族上游效應介質Caspase-12及Caspase-9實現(xiàn)凋亡信號的

20、啟動和傳導。腎絡通可以通過下調Caspase-12、Caspase-9蛋白表達來抑制腎小管上皮細胞凋亡，從而發(fā)揮腎臟保護作用。
　　5、Bcl-2家族在細胞凋亡信號傳導過程中發(fā)揮重要作用，其中Bcl-2為抑制凋亡因子，Bax為促進凋亡因子，兩者共同調控細胞存亡。腎絡通可以通過上調Bcl-2 mRNA及蛋白表達，下調Bax mRNA蛋白表達，且下調Bax/Bcl-2 mRNA表達，減少輸尿管梗阻后腎小管上皮細胞凋亡，起到腎臟保護作用