肺腺癌細(xì)胞中半乳糖凝集素--3與肝再生磷酸酶--3對(duì)RhoA--GTP磷酸化信號(hào)途徑激活方式的研究.pdf

1、肺腺癌細(xì)胞G a l e c t i n 一3 與P R L 一3 對(duì)R h o A —G T P 磷酸化信號(hào)途徑激活方式的研究 !肺腺癌細(xì)胞中半乳糖凝集素一3 與肝再生磷酸酶一3 對(duì)R h o A - G T P 磷酸化信號(hào)途徑激活方式的研究中文摘要目的：應(yīng)用基因分子生物學(xué)技術(shù)在肺腺癌細(xì)胞中探討G a l e c t i n 一3 與P h o s p h a t a s eo fR e g e n e r a t i n gL i

2、v e r 一3 ( P R L 一3 ) 在R h o A —G T P 磷酸化信號(hào)途徑激活過(guò)程中的相互作用，為進(jìn)一步研究肺腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的分子機(jī)制和肺腺癌分子治療方法提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：1 、使用攜帶G a l e c t i n 一3 m R N A 外顯子基因片段的G V 2 0 8 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建并篩選過(guò)表達(dá)G a l e c t i n - 3 的L T E P - a 2 肺腺癌細(xì)胞株。2 、用脂

3、質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將合成的靶向特異性s i R N A 使用L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0T r a n s f e c t i o nR e a g e n t 轉(zhuǎn)染L T E P —a 2 及A 5 4 9 肺腺癌細(xì)胞，干擾G a l e c t i n 一3 和P R L 一3蛋白的表達(dá)。3 、使用熒光定量R T —P C R 和W e s t e r nb l o t 方法在m R N A 水平

4、和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)G a l e c t i n 一3 、P R L 一3 和R h o A 的表達(dá)情況。結(jié)果：1 、A 5 4 9 細(xì)胞中使用靶向特異性s i R N A 單獨(dú)阻斷G a l e c t i n - 3 的表達(dá)后，P R L 一3 、R h o A蛋白的表達(dá)顯著降低( P < O ．0 1 ) ，提示G a l e c t i n 一3 影響P R L - 3 、R h o A 兩種蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)R h o

5、 A - G T P 信號(hào)途徑的激活，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。2 、A 5 4 9 細(xì)胞使用s i R N A 單獨(dú)阻斷P R L 一3 后，R h o A 蛋白表達(dá)減少( P < 0 ．0 1 ) ，而G a l e c t i n - 3 的表達(dá)則無(wú)明顯影響，提示P R L 一3 對(duì)R h o A 蛋白的表達(dá)具有直接調(diào)節(jié)作用，推測(cè)G a l e c t i n 一3 可能是通過(guò)P R L 一3 間接調(diào)節(jié)R h o A —

6、G T P 磷酸化信號(hào)途徑的激活。肺腺癌細(xì)胞G a l e c t i n 一3 與P R L 一3 對(duì)R h o A —G T P 磷酸化信號(hào)途徑激活方式的研究 三T h e s t u d y o f R h o A - ·G T Ps i g n a l i n g p a t h w a y a c t i v a t i o nm a n n e r s b y G a l e c t i n - - 3a n d

7、P h o s p h a t a s e o f R e g e n e r a t i n go b j e c t i v e ：T ■ ^ ● 1 1 ‘ ?‘ L l v e r - 3 i nl u n 2 a n e n o c a r c i n o m a c e l li l n eA b s t r a c tT o i n v e s t i g a t et h e p o s s i b l em e c h

8、 a n i s m o f i n t e r a c t i o n b e t w e e n G a l e c t i n - 3a n d P h o s p h a t a s e o fR e g e n e r a t i n g L i v e r - 3d u r i n ga c t i v i t i o no f R h o A - G T Ps i g n a l i n g p a t h w a y b

9、 y m o l e c u l a r b i o l o g yt e c h n i q u e s ，a n a l y s i sa n dv m f y t h e s ep r o t e i n m o l e c u l e sb y f u n c t i o n a le x p e r i m e n t s i nl u n ga d e n o c a r c i n o m a c e l ll i n e

10、 ．O u r s t u d y w i l lc o n t r i b u t e t ob e t t e ru n d e r s t a n d i n g o f t h e m o l e c u l a rm e c h a n i s m s i n v o l v e di nl u n g a d e n o c a r c i n o m a a n d b e h e l p f u lt od e v e

11、l g p m e n t o f n e w a p p r o a c h e sf o r C a n C e rm o l e c u l a r t h e r a p y ．M e t h o d s ：1 ．G a B - o v e r e x p r e s s e dL T E P —a 2 l u n ga d e n o c a r c i n o m a c e l ll i n e s w a s c o n

12、 s t r u c t e d u s i n gG V 2 0 8 l e n t i v i r a lv e c t o rc o n t a i n i n g G a l e e t i n - 3m R N A e x o nf r a g m e n t ．2 ．1 i p i d - m e d i a t e d t r a n s f e c t i o nw i t hL i p o f e c t a m i

13、n e2 0 0 0 T r a n s f e c t i o n R e a g e n t a n d t a r g e t i n gs p e c i f i cs i R N A w e r e u s e d t ot r a n s f e c tL T E P - a 2 a n d A 5 4 9 c e l ll i n e s ，e x p r e s s i o n o f G a l e c t i n 一

14、3 ，P R L - 3 a n d R h o A w e r e b l o c k e d r e s p e c t i v e l y i nt h e s ec e l l s ．3 ．T h ev a r y i n g m R N A l e v e l so f G a l e c t i n - 3 ，P R L - 3a n d R h o A w o r e a s s e s s e d b yo n e —s

15、 t e pR e a l - - t i m eQ u a n t i t a t i v e R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n ··P o l y m e r a s eC h a i n R e a c t i o n a n d f u r t h e r p r o t e i ne x p r e s s i o n l e v e l sw e r ea s

16、 s e s s e d b y W e s t e r n b l o t ．R e s u l t s ：1 ．W e s t e r n b l o ta n d R T - q P C R r e s u l t ss h o w e d t h a ta f t e r s p e c i f i c a l l yb l o c k i n g G a l e c t i n - 3 ，e x p r e s s i o n