肝再生磷酸酶-3表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)展及生物學(xué)行為的影響.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文肝再生磷酸酶3表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)展及生物學(xué)行為的影響姓名：黃德好申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：陳規(guī)劃20100518中山大學(xué)博士學(xué)位論文肝再生磷酸酶一3表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)展和生物學(xué)行為的影響尤其是與門(mén)脈內(nèi)癌栓形成之間的關(guān)系。2、構(gòu)建靶向PRL3基因的RNAi重組慢病毒載體，篩選出最佳干擾靶點(diǎn)并包裝獲得相應(yīng)的慢病毒。為研究PRL3基因表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為間的關(guān)系搭建技術(shù)平臺(tái)。3、研究PRL一3表達(dá)水平下調(diào)

2、引起的肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為改變，以期為肝細(xì)胞尋找基因治療的心方法。方法l、通過(guò)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、RealTimePCR技術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞系中PRL3基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況并篩選出表達(dá)水平最高的細(xì)胞。2、免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)PRL3在肝癌原發(fā)灶和門(mén)靜脈癌栓中的表達(dá)情況，分析其與肝癌臨床病理特點(diǎn)，特別是血管侵犯的關(guān)系。3、設(shè)計(jì)4個(gè)靶向PRL3基因的RNAi序列和一個(gè)陰性對(duì)照序列，合成各自的雙鏈寡核苷酸，構(gòu)建相應(yīng)的重組慢病毒質(zhì)粒

3、載體并分別命名為L(zhǎng)entivirus／CMV／GFPKDI、2、3、4和Lentivirus／CMV／GFPNC。行PCR和DNA測(cè)序鑒定。4、將四個(gè)靶點(diǎn)質(zhì)粒和一個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒分別進(jìn)行小量慢病毒包裝并分別感染肝癌HepG2細(xì)胞，根據(jù)RealTimePCR檢測(cè)所得的PRL3mRNA的抑制效率確定最佳RNAi序列。5、攜帶陰性對(duì)照序列和最佳RNAi序列的重組慢病毒的大量包裝并根據(jù)GFP的表達(dá)水平用稀釋法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。6、RealTime

4、PCR和WesternBlot分別檢測(cè)最佳靶點(diǎn)病毒感染后SMCC772l細(xì)胞中PRL3基因的沉默效果。7、CCK8增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRL3基因敲除對(duì)SMCC7721細(xì)胞體外增殖能力的影響。8、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PRL3基因敲除對(duì)SMCC7721細(xì)胞周期分布的影響。9、Tmnswell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRL3基因敲除對(duì)SMCC7721細(xì)胞體外遷移能力的影響。10、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRL3基因敲除對(duì)SMCC7721細(xì)胞體外遷移能力的影響。