電針對CSCI脫髓鞘病變的修復(fù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、脊髓壓迫性損傷（compressedspinalcordinjury,CSCI）是脊柱外科的常見病和多發(fā)病。椎骨骨折、脊柱結(jié)核、黃韌帶硬化、髓內(nèi)腫瘤、硬膜外血腫等均可造成CSCI。CSCI后，脊髓白質(zhì)發(fā)生脫髓鞘病變，是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的主要原因之一。其臨床表現(xiàn)為損傷平面以下運動障礙、感覺及括約肌功能部分或全部障礙，如未能及時治療，將導(dǎo)致不可逆的功能缺失，對患者的身心健康造成嚴(yán)重的傷害，給患者的家庭以及整個社會帶來極大的負(fù)擔(dān)。因此，對CS

2、CI誘導(dǎo)的脫髓鞘病變機(jī)制及其治療的研究具有十分重要的意義，已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。
　　近年來，臨床上治療CSCI的技術(shù)方法有激素沖擊治療、神經(jīng)營養(yǎng)因子的補充、組織工程支架的應(yīng)用以及干細(xì)胞移植等，均取得一定療效，但存在著費用昂貴、副作用大、細(xì)胞的來源有限以及社會倫理等各種問題。相反，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的藥物和手術(shù)療法相比，電針（electroacupuncture,EA）具有安全、簡便、無副作用等優(yōu)點，成為目前治療脊髓損傷的一種有效

3、的治療手段，已引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。但是，由于電針作用機(jī)理目前尚不清楚，阻礙了針灸在脊髓創(chuàng)傷領(lǐng)域的深入發(fā)展和廣泛應(yīng)用。目前，關(guān)于CSCI誘導(dǎo)的脫髓鞘病變和電針在促髓鞘修復(fù)的作用機(jī)制的相關(guān)報道較少，值得進(jìn)一步深入研究。
　　為此，本項目擬在制作CSCI模型的基礎(chǔ)上，采用透射電鏡、激光共聚焦、免疫印跡等分子生物學(xué)技術(shù)，從CSCI誘導(dǎo)的脫髓鞘病變機(jī)制以及電針對CSCI脫髓鞘病變保護(hù)的作用機(jī)制兩方面進(jìn)行研究。本研究結(jié)果將為闡明CSCI脫髓

4、鞘病變機(jī)制以及電針對脫髓鞘病變的作用機(jī)理提供實驗依據(jù)，具有重要的學(xué)術(shù)意義和臨床應(yīng)用價值。
　　目的：
　　1、探討大鼠CSCI脫髓鞘病變的相關(guān)病理機(jī)制。
　　2、CSCI后，采用電針治療，研究電針對脫髓鞘病變的修復(fù)作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1、成年健康Sprague-Dawley(SD)大鼠100只，隨機(jī)分為正常組（n=20）、假手術(shù)組（n=20）與模型組（n=60）。正常組給予常規(guī)飲食，不作任何干預(yù)

5、；假手術(shù)組僅做椎板切除術(shù)，不施壓；模型組又分為1、3、7d三個時間點，采用自行研制的壓迫器制作脊髓壓迫模型。運用BBB(Basso,Beattie,andBresnahan,BBB)運動功能評分評價大鼠后肢運動功能；通過鋨酸染色和透射電鏡檢測CSCI后1、3、7d白質(zhì)有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)的變化，并計算脊髓后索有髓神經(jīng)纖維數(shù)量以及G-ratio值（髓鞘厚度與軸突直徑的比值）；通過原位細(xì)胞凋亡（TdTmediateddUTP-biotinnic

6、kendlabeling，TUNEL)試劑盒于壓迫1、3、7d后檢測少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡情況；運用免疫熒光雙標(biāo)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)觀察Caspase-12、CytochromeC、Id2以及MBP的表達(dá)變化。
　　2、將72只SD大鼠分為對照組（n=36）和電針組（n=36），根據(jù)治療時間分別分為3、7、14d3個亞組。電針組于造模后，針刺大鼠雙側(cè)足三里和雙側(cè)太溪穴，并于雙側(cè)足三里和太溪穴進(jìn)行電針刺激（連續(xù)波，輸出頻率為2Hz，電壓1.5

7、V，30min）；對照組只造模，不治療。在不同治療時間點采用BBB進(jìn)行動物后肢運動功能評分，并運用電鏡觀察脊髓損傷節(jié)段髓鞘的超微結(jié)構(gòu)以及計算G-ratio值；采用5-乙炔基-2-脫氧尿苷（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）染色檢測少突膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（Oligodendrocyteprecursorcells，OPCs）、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖情況；采用免疫印跡技術(shù)和免疫熒光雙標(biāo)檢測Id2和少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄

8、因子（Oligodendrocytelineagegene2，Olig2）分別在OPCs里的表達(dá)變化；運用免疫印跡技術(shù)檢測Caspase-12、CytochromeC、MBP以及OPCs標(biāo)記物NG2的表達(dá)變化。
　　3、用SPSS統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠后肢運動功能評定結(jié)果顯示：正常組和假手術(shù)組大鼠后肢運動功能BBB評分為21分，模型組的BBB分值均明顯下降，與正常組和假手術(shù)組相比，差

9、異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在壓迫7d后BBB分值降至最低（P＜0.05）。鋨酸染色結(jié)果顯示：正常組和假手術(shù)組白質(zhì)均正常；CSCI后，模型組的有髓神經(jīng)纖維逐漸出現(xiàn)水腫、變性、崩解等潰變；隨著壓迫時間延長，模型組的纖維數(shù)量逐漸減少，在壓迫后第7d，有髓神經(jīng)纖維數(shù)量減至最低(P＜0.05）。電鏡結(jié)果顯示：正常組和假手術(shù)組的軸突、髓鞘板層結(jié)構(gòu)正常；脊髓受壓后，模型組的軸索腫脹，軸漿內(nèi)細(xì)胞器變性、缺失；髓鞘發(fā)生折疊、皺縮，出現(xiàn)“洋蔥皮”樣變

10、，逐漸崩解、變??；少突膠質(zhì)細(xì)胞的染色質(zhì)凝聚；隨著壓迫時間延長，模型組的G-ratio值逐漸下降，在壓迫后第7d，G-ratio降至最低（P＜0.05）。TUNEL結(jié)果顯示：CSCI后第1d即出現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并隨著壓迫時間延長，模型組凋亡的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，在第7d達(dá)到高峰（P＜0.05）。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示：正常組和對照組的caspase-12+-CNPase細(xì)胞、Cyt

11、ochromeC+-CNPase細(xì)胞以及Id2+-CNPase細(xì)胞數(shù)目較少，在白質(zhì)里散在分布；CSCI后，隨著壓迫時間延長，各時間點均有caspase-12+-CNPase細(xì)胞、CytochromeC+-CNPase細(xì)胞以及Id2+-CNPase細(xì)胞，并逐漸增多，廣泛分布在白質(zhì)里。免疫印跡法結(jié)果顯示：正常組、對照組胞漿Caspase-12、CytochromeC、Id2蛋白表達(dá)水平較低；隨著受壓時間延長，在壓迫后第7d三者蛋白水平均達(dá)到

12、峰值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。正常組MBP蛋白表達(dá)水平最高；隨著脊髓壓迫的時間延長，模型組的MBP蛋白表達(dá)量逐漸下降，在壓迫后7d表達(dá)最低（P＜0.05）。
　　2、電針干預(yù)后，BBB評分結(jié)果顯示：3、7d對照組和電針組組間及組內(nèi)相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），14d電針組分別與7d電針組及同時期的對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同時間點的對照組均有程度不等的軸突腫脹，軸漿內(nèi)細(xì)胞器變性、丟失，

13、髓鞘出現(xiàn)水腫，髓鞘板層結(jié)構(gòu)紊亂、增厚，直至潰變、崩解；電針組的髓鞘、軸突腫脹程度比同時期的對照組略輕，髓鞘結(jié)構(gòu)較為致密。G-ratio值顯示，3、7d對照組和電針組組間及組內(nèi)相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），14d電針組分別與7d電針組及同時期的對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。EdU染色檢測結(jié)果顯示：電針組的EdU+-NG2細(xì)胞和EdU+-CNPase細(xì)胞數(shù)目隨著治療時間延長逐漸增多，在治療14d后，EdU+-N

14、G2細(xì)胞和EdU+-CNPase細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最大值（P＜0.05），和同時間點的對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；EdU+-GFAP細(xì)胞數(shù)目隨著治療時間延長也逐漸增多，但和同時間點的對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對照組和電針組的Id2+-NG2細(xì)胞在治療初期廣泛分布于白質(zhì)里，隨著治療時間延長，兩組的Id2+-NG2細(xì)胞在白質(zhì)里逐漸散在分布，兩組的Id2蛋白表達(dá)水平隨時間延長均逐漸下降，在治療14d后降至最低

15、值（P＜0.05），同一時間點兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組和電針組的Olig2+-NG2細(xì)胞在治療初期散在分布于白質(zhì)里，隨著治療時間延長，兩組的Olig2+-NG2細(xì)胞在白質(zhì)里逐漸廣泛分布，兩組的Olig2蛋白表達(dá)水平隨時間延長均逐漸增加，在治療14d后達(dá)到最大值（P＜0.05），同一時間點兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。免疫印跡結(jié)果顯示：對照組和電針組的Caspase-12和CytochromeC表達(dá)

16、隨著治療時間延長逐漸下降，在治療14d后降至最低值（P＜0.05），同時間點的兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組和電針組的MBP和NG2蛋白表達(dá)隨時間延長均逐漸上調(diào)，在治療14d后達(dá)到最大值（P＜0.05），同一時間點兩組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、CSCI后，有髓神經(jīng)纖維發(fā)生脫髓鞘病變，隨著壓迫時間延長，潰變進(jìn)行性加重，導(dǎo)致運動功能缺損，脫髓鞘病變的病理機(jī)制與少突膠質(zhì)細(xì)胞

17、凋亡以及MBP的崩解密切相關(guān)。而少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡又與Caspase-12表達(dá)增強、CytochromeC釋放以及Id2表達(dá)上調(diào)三者共同作用有關(guān)。
　　2、CSCI后，電針刺激可改善大鼠運動功能，其作用機(jī)制主要是下調(diào)Id2、增強Olig2的表達(dá)，促進(jìn)OPCs和少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化成熟以幫助再髓鞘化；同時抑制Caspase-12表達(dá)和CytochromeC的釋放，減少少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡，以此減輕脫髓鞘病變癥狀，幫助受損神經(jīng)纖維實現(xiàn)