多覺(jué)型C纖維傳導(dǎo)丟峰的活動(dòng)規(guī)律與機(jī)制及其外周鎮(zhèn)痛作用.pdf

1、外周無(wú)髓鞘纖維C類傳入纖維是由背根節(jié)小細(xì)胞發(fā)出的外周突,其主要功能是將外周的傷害性信息傳入脊髓。長(zhǎng)期以來(lái),人們認(rèn)為軸突只是一根相對(duì)簡(jiǎn)單的“導(dǎo)線”,其任務(wù)是忠實(shí)地傳導(dǎo)攜帶神經(jīng)信息的動(dòng)作電位序列。然而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn):無(wú)髓鞘纖維的傳導(dǎo)功能具有傳導(dǎo)速度活動(dòng)依賴性減慢和傳導(dǎo)丟峰現(xiàn)象,使得動(dòng)作電位序列的傳入模式和數(shù)量都發(fā)生改變。結(jié)果提示C纖維并非忠實(shí)地傳遞神經(jīng)信息,可能在傳導(dǎo)過(guò)程中對(duì)放電序列進(jìn)行信息加工和整合。
　　我室前期工作發(fā)現(xiàn)家兔隱

2、神經(jīng)C纖維具有傳導(dǎo)丟峰現(xiàn)象,傳導(dǎo)丟峰現(xiàn)象是指動(dòng)作電位序列在軸突上傳遞過(guò)程中發(fā)生丟失的現(xiàn)象,并將丟峰模式分為三類:不丟峰、規(guī)則丟峰和不規(guī)則丟峰。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病理痛模型尾神經(jīng)中多覺(jué)型傷害性C纖維的傳導(dǎo)丟峰程度顯著下降,并伴隨著初始傳導(dǎo)速度加快以及傳導(dǎo)速度活動(dòng)依賴性減慢程度降低等現(xiàn)象,提示傳導(dǎo)丟峰程度的減弱參與了糖尿病神經(jīng)痛敏的形成。但是多覺(jué)型傷害性C纖維傳導(dǎo)丟峰程度的變化在慢性炎癥痛敏形成過(guò)程起到什么作用?哪些關(guān)鍵離子通道電流和

3、分子參與了傳導(dǎo)丟峰的調(diào)變機(jī)制?通過(guò)何種途徑可能增加傳導(dǎo)丟峰程度,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛效應(yīng)?這將是我們接下來(lái)研究課題的主要內(nèi)容。
　　本研究以CFA慢性炎性痛模型尾神經(jīng)中多覺(jué)型傷害性C纖維為對(duì)象,運(yùn)用在體單纖維記錄的方法研究C纖維傳導(dǎo)丟峰的規(guī)律和特征。以C纖維的胞體—DRG小細(xì)胞為標(biāo)本,采用整節(jié)DRG膜片鉗記錄的方法研究傳導(dǎo)丟峰發(fā)生的離子通道機(jī)制。采用免疫組織化學(xué)染色的方法觀察DRG小細(xì)胞和C纖維上相關(guān)通道表達(dá)的變化。最后通過(guò)在坐骨神經(jīng)周圍

4、注射Ih電流的特異阻斷劑ZD7288研究增加傳導(dǎo)丟峰對(duì)動(dòng)物痛敏行為的影響。
　　第一部分:傳導(dǎo)丟峰的特征及規(guī)律
　　實(shí)驗(yàn)以尾部皮下注射CFA3-5天的大鼠尾神經(jīng)中多覺(jué)型傷害性C纖維為研究對(duì)象,在感受野皮下給予不同頻率的電刺激,在記錄電極和刺激電極之間的神經(jīng)干施加藥物,采用在體單纖維記錄的方法研究傳導(dǎo)丟峰的規(guī)律和特征,結(jié)果表明:
　　1.通過(guò)感受野對(duì)機(jī)械傷害性刺激和熱傷害性刺激均起反應(yīng)的C纖維定為多覺(jué)型傷害性C纖維,僅對(duì)

5、機(jī)械刺激發(fā)生反應(yīng)的C纖維定為機(jī)械敏感C纖維。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10 Hz電刺激頻率下多覺(jué)型傷害性C纖維傳導(dǎo)丟峰程度顯著大于機(jī)械敏感C纖維(多覺(jué)型傷害性C纖維組:45.8％±4.7%,機(jī)械敏感C纖維組:5.8%±2.4%,P<0.05)。重復(fù)刺激多覺(jué)型傷害性C纖維時(shí),傳導(dǎo)速度減慢程度(Slowing of conduction velocity,CVs)顯著大于機(jī)械敏感C纖維組(多覺(jué)型傷害性C纖維:35.5%±1.5%,機(jī)械敏感C纖維:9.1%±

6、0.7%,P<0.05)。但兩者初始傳導(dǎo)速度(Initial conduction velocity,CVi)并無(wú)顯著差異(多覺(jué)型C纖維組:0.75±0.04 m/s,機(jī)械敏感C纖維組:0.82±0.07 m/s,P>0.05)。
　　2.在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中以多覺(jué)型傷害性C纖維為研究對(duì)象。在感受野給予2 Hz,5 Hz和10 Hz的電刺激,與正常對(duì)照組相比,CFA組多覺(jué)型傷害性C纖維的丟峰程度均顯著降低,隨著刺激頻率的增高傳導(dǎo)丟峰程度

7、相應(yīng)增大。CFA組丟峰程度分別為0.73%±0.31%,8.03%±1.83%和16.58%±3.46%,正常對(duì)照組的傳導(dǎo)丟峰程度分別為5.36%±2.51%,30.99%±4.08%和50.55%±4.39%,在5 Hz和10 Hz電刺激頻率下CFA組傳導(dǎo)丟峰程度顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)。在2 Hz電刺激頻率下測(cè)量初始傳導(dǎo)速度,CFA慢性炎性痛后初始傳導(dǎo)速度顯著增加(CFA組:0.79±0.02 m/s,對(duì)照組:0.69±0

8、.02 m/s,P<0.05),但傳導(dǎo)速度減慢程度卻顯著降低(CFA組:19.51%±1.1%,對(duì)照組:24.96%±0.7%,P<0.05)。
　　3.在記錄電極和刺激電極之間的神經(jīng)干上分別施加不同濃度的Ih電流的特異阻斷劑ZD7288(5,10,20,40μM),在10 Hz電刺激頻率下ZD7288濃度依賴性地增加傳導(dǎo)丟峰程度(依次為30.63%±2.56%,32.51%±1.82%,39.35%±3.25%,50.93%±3

9、.64%),施加ZD7288前傳導(dǎo)丟峰程度為15.44%±2.61%(P<0.05)。在2 Hz電刺激頻率下觀察ZD7288(40μM)對(duì)傳導(dǎo)速度特性的影響,發(fā)現(xiàn)加藥后CVs顯著增大(加藥前:19.11%±1.41%,加藥后:22.51%±2.42%,P<0.05),但對(duì)CVi卻沒(méi)有顯著影響(加藥前:0.78±0.02 m/s,加藥后:0.75±0.02 m/s,P>0.05)。
　　4.ZD7288活動(dòng)依賴性增加傳導(dǎo)丟峰程度。C

10、FA組多覺(jué)型C纖維在2 Hz電刺激頻率下均不丟峰,施加ZD7288(40μM)后丟峰程度為2.08%±2.08%,兩者沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在5 Hz的電刺激下,丟峰程度由原來(lái)的3.73%±2.14%增加到15.67%±4.21%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在10 Hz電刺激頻率下,丟峰程度由15.44%±2.6%增加到50.93%±3.64%,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　5.在同樣的電刺激頻率(10 Hz)下

11、,ZD7288(150μM)選擇性增加多覺(jué)型傷害性C纖維的傳導(dǎo)丟峰程度并降低初始傳導(dǎo)速度,但是對(duì)有髓鞘A類纖維的傳導(dǎo)速度無(wú)顯著影響,也未出現(xiàn)傳導(dǎo)丟峰現(xiàn)象,表明 ZD7288選擇性增加多覺(jué)型傷害性 C纖維的傳導(dǎo)丟峰程度而不影響有髓鞘A類纖維傳導(dǎo)。
　　6.CFA后,大約20%的C纖維出現(xiàn)自發(fā)放電,放電頻率在0.5 Hz-3 Hz之間。在神經(jīng)干施加不同濃度的ZD7288(40μM,150μM,500μM),可濃度依賴性抑制自發(fā)放電頻率

12、,(加藥后分別為:0.90±0.11 Hz,0.59±0.05 Hz,0.45±0.03 Hz,加藥前:1.32±0.18 Hz,P<0.05),且加藥后自發(fā)放電的脈沖間距(Interspike interval,ISI)相應(yīng)增加。
　　7.在記錄電極和刺激電極之間的神經(jīng)干上施加低閾值鉀電流的特異阻斷劑α-DTX(0.5 nM),可顯著降低傳導(dǎo)丟峰程度(加藥前:35.45%±4.23%,加藥后:8.42%±1.43%,P<0.05

13、)。施加α-DTX后初始傳導(dǎo)速度顯著增加(加藥前:0.69±0.02 m/s,加藥后:0.78±0.01 m/s,P<0.05),但CVs顯著減小(加藥前:23.5%±0.71%,加藥后:17.1%±0.79%,P<0.05)。
　　第二部分:傳導(dǎo)丟峰離子通道機(jī)制
　　由于C纖維的直徑較小,難以直接對(duì)其離子通道機(jī)制進(jìn)行研究。而C纖維是由 DRG小細(xì)胞發(fā)出的外軸突,軸突上通道蛋白在胞體合成后運(yùn)輸?shù)捷S突特定部位,所以本部分實(shí)驗(yàn)通

14、過(guò)膜片鉗記錄慢性炎性痛DRG小細(xì)胞上離子通道電流和興奮性的變化來(lái)反映軸突興奮性和離子通道的變化。
　　1.CFA后DRG小細(xì)胞基強(qiáng)度下降、閾值偏向超極化和動(dòng)作電位上升斜率增大,表明DRG小細(xì)胞興奮性顯著升高,但靜息膜電位并未發(fā)生顯著變化。
　　2.在記錄浴槽中施加低閾值鉀通道阻斷劑α-DTX(100 nM),可增加不同強(qiáng)度的去極化刺激誘發(fā)的DRG小細(xì)胞的放電數(shù)目,動(dòng)作電位的閾值偏向更超極化水平,基強(qiáng)度減小,但是對(duì)動(dòng)作電位的幅

15、度、波寬和上升斜率沒(méi)有顯著影響。
　　3.CFA組DRG小細(xì)胞α-DTX敏感鉀電流顯著減小(P<0.05),但是其激活特性未發(fā)生顯著的變化。
　　4.先將細(xì)胞鉗制在-60 mV,然后在-60 mV到-130 mV之間再分別施加持續(xù)6 s的不同超極化水平的鉗制,發(fā)現(xiàn)CFA后DRG小細(xì)胞Ih電流從-110 mV起顯著增大(P<0.05)。
　　5.CFA組DRG小細(xì)胞放電的后超極化電位(AHP)的幅度和時(shí)程均顯著減小(P<

16、0.05),當(dāng)在浴槽中施加 ZD7288(40μM)時(shí)可顯著增大CFA組AHP幅度(正常組AHP幅度:12.2±0.62 mV,n=15;CFA組AHP幅度:8.1±0.74 mV,n=12;CFA+ZD7288組:10.5±0.53 mV,n=12,P<0.05)和時(shí)程(對(duì)照組AHP半寬:30.2±2.5 ms,n=15;CFA組AHP半寬:15.8±2.7 ms,n=12;CFA+ZD7288組:25.6±3.3 ms,n=12,P

17、<0.05)。
　　第三部分:慢性炎癥DRG小細(xì)胞和C纖維上HCN1和HCN2通道表達(dá)增加
　　本部分采用免疫組織化學(xué)的方法觀察CFA組DRG小細(xì)胞和C纖維上HCN1和HCN2通道表達(dá)的變化。
　　1.CFA組DRG小細(xì)胞和C纖維上HCN1通道表達(dá)均上調(diào),DRG小細(xì)胞上HCN1的熒光強(qiáng)度增加(CFA組:49.5±4.3,對(duì)照組:23.4±3.8,P<0.05),C纖維HCN1通道熒光強(qiáng)度增加(CFA組:45.8±5.4

18、,對(duì)照組17.6±3.5,P<0.05)。
　　2.CFA DRG小細(xì)胞和C纖維上HCN2通道表達(dá)均上調(diào),DRG小細(xì)胞上HCN2的熒光強(qiáng)度增加(CFA組:64.5±8.6,對(duì)照組:26.5±6.8,P<0.05),C纖維HCN2通道熒光強(qiáng)度增加(CFA組:44.6±7.6,對(duì)照組20.3±4.2,P<0.05)。
　　第四部分:坐骨神經(jīng)周圍局部注射Ih電流的特異阻斷劑ZD7288抑制機(jī)械痛敏和熱痛敏
　　本部分實(shí)驗(yàn)采用

19、在坐骨結(jié)節(jié)和大轉(zhuǎn)子之間的坐骨神經(jīng)周圍注射不同濃度ZD7288(15μM,50μM,150μM,500μM)的方法觀察增加傳導(dǎo)丟峰程度對(duì)動(dòng)物痛敏行為反應(yīng)的影響,還同時(shí)觀察這種給藥方法對(duì)運(yùn)動(dòng)功能和心率變化的影響。
　　1.坐骨神經(jīng)周圍注射ZD7288可濃度和時(shí)間依賴性地部分抑制機(jī)械痛敏和熱痛敏,ZD7288可濃度依賴性地抑制福爾馬林炎性痛動(dòng)物的自發(fā)痛行為。
　　2.坐骨神經(jīng)周圍注射ZD7288不影響動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能。
　　3

20、.坐骨神經(jīng)周圍注射ZD7288(500μM,0.2 ml)不影響動(dòng)物心率,但腹腔注射(4 mg/kg)可顯著降低動(dòng)物心率。
　　主要結(jié)論:
　　1.在CFA慢性炎性痛模型,發(fā)現(xiàn)多覺(jué)型傷害性C纖維的傳導(dǎo)丟峰程度顯著降低。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)ZD7288可濃度依賴性和活動(dòng)依賴性地增加多覺(jué)型傷害性C纖維的傳導(dǎo)丟峰程度,但不影響有髓鞘 A類神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)活動(dòng),起著選擇性減少痛信號(hào)傳入的作用。
　　3.在坐骨神經(jīng)周圍局部注射