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文檔簡(jiǎn)介
1、飛龍掌血Toddalia asiatica Lam.為蕓香科(Rutaceae)飛龍掌血屬(Toddalia)植物,在我國(guó)的地理位置分布為秦嶺以南各地。味辛、微苦,性溫,具有祛風(fēng)除濕、散瘀止血、消腫解毒的功效。飛龍掌血主要用來(lái)治療跌打損傷、風(fēng)濕骨痛、腰痛、痛經(jīng)以及毒蛇咬傷等病癥,效果顯著,且民間用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的藥用歷史悠久。生物堿類(lèi)與香豆素是該植物中的兩大類(lèi)主要成分,關(guān)于其發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用的活性成分及作用機(jī)制的報(bào)道均較少
2、。本課題擬進(jìn)一步研究飛龍掌血的鎮(zhèn)痛抗炎活性部位和活性單體成分,并考察其發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用的機(jī)制。
一.飛龍掌血各部位的免疫調(diào)節(jié)作用及其鎮(zhèn)痛抗炎活性的研究
將藥材粗粉采用熱回流提取得到總膏,依次萃取得生物堿部位和乙酸乙酯部位(將其進(jìn)一步分為EⅠ、EⅡ、EⅢ三個(gè)部位)并作為研究對(duì)象,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下:
1.免疫調(diào)節(jié)作用的考察:生物堿部位和乙酸乙酯部位對(duì)刀豆蛋白A和脂多糖誘導(dǎo)小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行M
3、TT檢測(cè),然后對(duì)T細(xì)胞CD4與 CD8亞群進(jìn)行流式檢測(cè),結(jié)果表明它們均能通過(guò)改變 T淋巴細(xì)胞(CD4+、CD8+)的數(shù)目或亞群來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。
2.體內(nèi)鎮(zhèn)痛抗炎活性研究:采用小鼠醋酸扭體、熱板法和二甲苯致小鼠耳腫脹三個(gè)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示生物堿部位、乙酸乙酯部位及其EⅠ部位具有較好的鎮(zhèn)痛及抗炎活性,能顯著抑制小鼠的扭體反應(yīng)和耳腫脹程度,降低痛閾值。同時(shí)采用納洛酮拮抗實(shí)驗(yàn)和利血平影響實(shí)驗(yàn)初步考察其鎮(zhèn)痛機(jī)制,結(jié)果表明生物堿部位的鎮(zhèn)
4、痛作用受到利血平的拮抗,而乙酸乙酯及其EⅠ部位的鎮(zhèn)痛作用部分被納洛酮拮抗。
3.抗RA活性研究:采用Ⅱ型膠原建立CIA小鼠模型,檢測(cè)各部位對(duì)CIA小鼠的體重、足腫脹程度、脾臟指數(shù)、關(guān)節(jié)病理變化及評(píng)分、血清中細(xì)胞因子水平的影響,結(jié)果表明生物堿部位和乙酸乙酯EⅠ部位對(duì)CIA模型均具有顯著的改善作用,能通過(guò)緩解脾臟腫大及調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α與白介素-17、-6、-10四種因子的水平而改善其足墊和踝關(guān)節(jié)的腫脹,抑制滑膜和軟骨的異常增生
5、與侵蝕等。
二.飛龍掌血的體外抗炎活性及機(jī)制的研究
以飛龍掌血浸膏及部分單體化合物(香豆素和生物堿)為研究對(duì)象,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下:
1.對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響:采用MTT法研究其對(duì)該模型是否具有細(xì)胞毒作用,結(jié)果表明其總膏、生物堿部位和乙酸乙酯EⅠ部位以及茴芹內(nèi)酯、toddaculin、異茴芹內(nèi)酯、氧化白屈菜堿在高濃度時(shí)具有一定的細(xì)胞毒性,而omphalocarpin、二氫白屈菜紅堿
6、、茵芋堿、γ-花椒堿均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性。
2.對(duì)NO水平的調(diào)節(jié):采用Griess法檢測(cè)它們對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO水平的影響,結(jié)果顯示除茴芹內(nèi)酯、toddaculin、異茴芹內(nèi)酯、氧化白屈菜堿以外,其余成分均具有一定的NO抑制作用。
3.對(duì)TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS水平的影響:采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中幾種炎癥介質(zhì)水平的變化,結(jié)果表明飛龍掌血總膏、生物堿部位和乙酸乙酯EⅠ部位以及omphalo
7、carpin、茵芋堿均可顯著下調(diào)這幾種因子的水平。
4.茵芋堿與omphalocarpin對(duì)COX-2、iNOS的表達(dá)以及NF-κB通路的影響:采用Western Blotting法,結(jié)果顯示二者均能顯著抑制COX-2和iNOS兩種蛋白的表達(dá)及 NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性(抑制胞漿中 IκB-α蛋白的磷酸化以及 NF-κB p65蛋白易位至細(xì)胞核的水平),說(shuō)明它們可能通過(guò)抑制 NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)各種炎性介質(zhì)如NO、TNF-α、
8、IL-6、COX-2和iNOS的水平。
5.對(duì)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)的增殖及其釋放MMP-3和IL-1β的影響:采用CCK-8法研究對(duì)RA FLS增殖的作用,并運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期的影響,ELISA法檢測(cè)MMP-3和IL-1β的水平,結(jié)果表明飛龍掌血總膏、生物堿部位和乙酸乙酯EⅠ部位以及茵芋堿、omphalocarpin均能使細(xì)胞大量停留于DNA合成前期,從而抑制 TNF-α誘導(dǎo) RA FLS增殖的程度,同時(shí)
9、明顯下調(diào)RA FLS分泌MMP-3和IL-1β的水平。
三.主要化學(xué)成分的鎮(zhèn)痛抗炎活性研究
以茴芹內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、omphalocarpin和茵芋堿四個(gè)主要成分為研究對(duì)象,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下:
1.體內(nèi)鎮(zhèn)痛抗炎活性研究:采用小鼠醋酸扭體、熱板法和二甲苯致小鼠耳腫脹三個(gè)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示茵芋堿與omphalocarpin具有較好的活性,能顯著抑制小鼠的扭體反應(yīng)和耳腫脹程度,降低痛閾值。同時(shí)采用納洛酮拮抗實(shí)驗(yàn)和利
10、血平影響實(shí)驗(yàn)初步考察其鎮(zhèn)痛機(jī)制,結(jié)果表明二者的鎮(zhèn)痛作用受到利血平的拮抗,而不受納洛酮的影響。
2.抗 RA活性研究:采用Ⅱ型膠原作為誘導(dǎo)劑以建立關(guān)節(jié)炎小鼠模型,檢測(cè)單體成分對(duì)CIA小鼠的體重、足腫脹程度、脾臟指數(shù)、關(guān)節(jié)病理變化及評(píng)分、血清中細(xì)胞因子水平的影響,結(jié)果表明茵芋堿對(duì)CIA小鼠的關(guān)節(jié)癥狀具有明顯的緩解作用,能通過(guò)減輕脾臟腫大及調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α與白介素-1β、-6、-10的水平而改善其足墊和踝關(guān)節(jié)的腫脹,抑制滑膜和軟
11、骨的異常增生與侵蝕等。
本課題進(jìn)一步明確了飛龍掌血的鎮(zhèn)痛抗炎活性成分及其機(jī)制,并首次篩選了飛龍掌血中主要單體成分的鎮(zhèn)痛抗炎活性及抗RA作用;首次采用T、B淋巴細(xì)胞的體外增殖模型研究了飛龍掌血的免疫調(diào)節(jié)作用;首次采用納洛酮拮抗實(shí)驗(yàn)和利血平影響實(shí)驗(yàn)初步考察了各活性成分的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制;同時(shí)首次通過(guò) LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖和TNF-α誘導(dǎo)大鼠RA FLS增殖的模型深入探究了飛龍掌血的抗炎作用機(jī)制。以上結(jié)果說(shuō)明飛龍掌血可
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