精子DNA碎片的臨床意義：臨床和實驗研究.pdf

1、精子DNA碎片（sperm DNA fragmentation，SDF）已經(jīng)成為反映男性生育能力的一個獨立的生物學和臨床指標。高SDF影響自然生育和宮腔內(nèi)人工授精等體內(nèi)受精方式的生育能力。但SDF對常規(guī)體外受精（in vitro fertilization，IVF）和單精子卵胞漿內(nèi)注射術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的臨床結(jié)果和出生后代的影響仍未定論。而這一問題在目前IVF和ICSI廣泛應

2、用于精液異常的男性不育癥的時代尤顯重要，因為男性精液指標異常不育患者存在明顯增高的SDF。本研究分三個部分:1、通過臨床研究闡明SDF對IVF和ICSI的臨床結(jié)果的影響;2、通過動物實驗研究高SDF對ICSI小鼠子代的遺傳學和表觀遺傳學影響，探討SDF對ICSI后代影響的機制;3、探討環(huán)境污染物鄰苯二甲酸二-2-乙基己基酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)對SDF的影響以及其產(chǎn)生生殖毒性的機制。
　　

3、第一部分精子DNA碎片對IVF和ICSI臨床結(jié)果的影響
　　回顧性分析了2009年4月至2012年12月期間在本生殖中心就診的連續(xù)3350個首次IVF和ICSI周期。正常卵巢儲備功能女性病人采取標準黃體期降調(diào)長方案(standard leuteal down regulation long regimen，LP)治療，潛在卵巢儲備功能下降的女性病人則采用短方案(short flare-up regimen，SP)。采用SP的具體條

4、件是基礎(chǔ)FSH＞10 IU/L或基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)＜6或年齡≥38歲。在病人進入周期前1-2個月，采用染色質(zhì)擴散實驗(sperm chromatin dispersion，SCD)對所有男性病人行精子DNA損傷程度檢測。將所有病例分為LP/IVF、LP/SCSI、SP/IVF和SP/ICSI等4組，將SDF分析閾值分別定為20％、30％和40％。分析4組中SDF值與IVF或ICSI的受精率、卵裂率、早期胚胎質(zhì)量、胚胎種植率(implantat

5、ionrate，IR)、臨床妊娠率(clinical pregnancy rate，CPR)和早期流產(chǎn)率等臨床結(jié)果的關(guān)系。結(jié)果表明:在LP/IVF組，當SDF≥20％和≥30％時， IR顯著下降，CPR也有下降趨勢，但無統(tǒng)計學顯著性意義;當SDF≥40％時，早期流產(chǎn)率顯著增加;不同SDF閾值時，高SDF組與低SDF組的受精率和早期胚胎質(zhì)量均無顯著性差異。在LP/ICSI組，高SDF組與低SDF組的各項臨床結(jié)果均無顯著差異。然而，在SP/

6、IVF組和SP/ICSI組，當SDF閾值分別為20％，30％和40％時，各組高水平SDF與IVF和ICSI的IR和CPR均有顯著的負相關(guān);在SP/ICSI組，高SDF顯著影響受精率及胚胎質(zhì)量。研究結(jié)果表明:SDF影響IVF和ICSI的臨床結(jié)果，在卵巢儲備功能低下的病人中尤為顯著;這提示卵子質(zhì)量在SDF對IVF和ICSI的影響中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分精子DNA碎片對子代遺傳學和表觀遺傳學的影響
　　輔助生殖技術(shù)(Assi

7、sted Reproductive Technology, ART)是解決低生育力夫婦生育問題的有效治療手段，然而其安全性問題，特別是不育人群本身攜帶的遺傳缺陷對子代遺傳及表觀遺傳的影響鮮有深入研究。本研究旨在研究DNA損傷精子行ICSI獲得的子代，通過應用轉(zhuǎn)基因小鼠-Big Blue(R)這種公認的突變檢測模型來探討其遺傳學和表觀遺傳學是否發(fā)生改變。實驗以B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)野生型小鼠和Big Blue(R)小鼠

8、作為精子和卵子供體。將其精子反復凍融后獲得DNA損傷精子，繼而利用ICSI-ET技術(shù)獲得子代。通過收集孕中期胚胎，提取全基因組DNA、回收及體外包裝λ噬菌體、鋪板展示、lacI突變體篩選、擴增測序等等，最終確定精子DNA損傷誘導子代基因組點突變的發(fā)生率。另一方面，通過對孕中期胚胎印記基因H19和Snrpn DMR甲基化狀態(tài)進行研究，以期探討精子DNA損傷是否引起表觀遺傳學上的變化。研究發(fā)現(xiàn)，以Big Blue(R)轉(zhuǎn)基因小鼠為精子供體的

9、胎鼠，檢測突變的lacI基因位于親代精子上，那么子代基因組若發(fā)生突變則來源于父源性突變，結(jié)果顯示，實驗組突變率（1.45±0.34）×10-5顯著高于對照組（1.03±0.09）×10-5的突變率水平(P=0.0049);而以Big Blue(R)轉(zhuǎn)基因小鼠為卵子供體的胎鼠，因為檢測突變的lacI基因位于親代卵子上，子代基因組若發(fā)生突變則來源于母源性突變，實驗組突變率（1.64±0.22）×10-5顯著高于對照組（0.98±0.12）×

10、10-5的突變率水平(P=0.0008)。同時，印記基因H19和Snrpn DMR的甲基化水平也發(fā)生顯著變化，其中H19異常高甲基化（實驗組69.9％ vs.對照組52.5％，P=0.0375），Snrpn異常低甲基化(實驗組31.5％ vs.對照組53.0％，P=0.0451)。本研究結(jié)果顯示，精子DNA損傷將對子代遺傳和表觀遺傳的穩(wěn)定性產(chǎn)生重大風險，提示在ART診療過程中，配子自身攜帶的遺傳缺陷對子代健康的影響應當引起廣泛重視。

11、r>　　第三部分鄰苯二甲酸二-（2-乙基己基）酯對精子DNA損傷、體外受精及其胚胎發(fā)育潛能的影響
　　鄰苯二甲酸二-（2-乙基己基）酯(di-(2-ethylhcxyl)phthalate，DEHP）作為全球范圍內(nèi)嚴重的工業(yè)污染物，其生殖毒性作用越來越受到人們的關(guān)注。我們通過小鼠體外受精-胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)研究低劑量DEHP(1μg/ml)離體暴露對精子受精過程和胚胎發(fā)育潛能的影響。同時，借助Big Blue(R)轉(zhuǎn)基因小鼠這種公認的突

12、變檢測系統(tǒng)，通過在體染毒(500 mg/kg/day)探討DEHP對睪丸基因組突變率的影響。離體實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，低劑量DEHP暴露(1μg/ml，30min)能夠顯著影響受精率和后續(xù)的胚胎發(fā)育過程(P＜0.05)，移植胚胎的出生率也顯著下降(P＜0.05)。我們同時收集小鼠體內(nèi)受精的受精卵和2-cell胚胎進行體外暴露培養(yǎng)實驗（1μg/ml），發(fā)現(xiàn)受精卵的后續(xù)發(fā)育顯著受損而2-cell胚胎的發(fā)育潛能與對照組差異不大，提示低劑量D

13、EHP離體暴露能夠?qū)κ芫^程和胚胎發(fā)育潛能產(chǎn)生顯著影響，而其作用位點主要集中在受精過程和第一次卵裂階段。在小鼠在體染毒實驗中，4周的DEHP染毒能夠顯著增加睪丸基因組的突變率，約為對照組的3倍(P＜0.05)。而對離體暴露和在體染毒的精子進行DNA損傷檢測后發(fā)現(xiàn)，DEHP并未顯著提高精子DNA損傷程度?？偟膩碚f，無論是離體暴露影響受精過程和胚胎發(fā)育潛能，還是在體染毒對睪丸基因組的致突變作用，DEHP對人類生殖健康都存在巨大威脅，而這種生