NR2A亞單位胞內(nèi)C末端區(qū)對(duì)NMDA受體裝配、運(yùn)輸以及表面表達(dá)的影響.pdf

1、NMDA受體是由NR1和NR2亞單位組成的異聚體復(fù)合物，亞單位之間的裝配對(duì)于NMDA受體通道的形成和表面表達(dá)至關(guān)重要。以往的研究提示，NR2亞單位胞內(nèi)C末端區(qū)可能參與調(diào)節(jié)NMDA受體的表面表達(dá)和突觸定位。 本研究的第一部分通過一系列C末端截短的NR2A亞單位突變體的構(gòu)建以及NMDA受體膜表面表達(dá)和功能的檢測(cè)，在HEK293細(xì)胞和培養(yǎng)海馬神經(jīng)元研究了NR2A亞單位的C末端在NMDA受體裝配和表面表達(dá)中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NR2A亞

2、單位的C末端截短后其TM4下游分別剩下59、5、3個(gè)氨基酸殘基時(shí)(2A△59、2A△5和2A△3)，它們均能與NR1-1a形成有功能的受體通道并表達(dá)于細(xì)胞膜表面，但是與未截短的NR2A相比其表面表達(dá)均有所下降；并且，當(dāng)2A△5的TM4下游僅存的5個(gè)氨基酸EHLFY突變成EAAAA(2A△5EAAAA)時(shí)，仍可與NR1-1a形成受體復(fù)合物并表達(dá)于細(xì)胞膜表面。若將NR2A的C末端截短僅保留TM4后的1個(gè)氨基酸時(shí)(2A△1)，該突變體與NR1

3、-1a共轉(zhuǎn)染時(shí)，就不再獲得受體復(fù)合物的細(xì)胞膜表面表達(dá)，也不能記錄到谷氨酸誘發(fā)的電流。有趣的是，當(dāng)NR1-4a與2A△1共轉(zhuǎn)染時(shí)，NR1-4a/2A△1受體復(fù)合物仍然能表達(dá)于HEK293細(xì)胞表面，并能檢測(cè)到通道功能。在此，與NR1-1a不同的是NR1-4a不含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留基序列。以上結(jié)果提示，NR2A亞單位TM4后的3個(gè)氨基酸是NR1-1a/NR2A受體復(fù)合物細(xì)胞膜表面表達(dá)所必需的，然而，NR2A亞單位的C末端并不是NR2A與NR1裝配和

4、形成功能性通道所必需的，但能幫助NR1-1a克服內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留作用使NMDA受體復(fù)合物表達(dá)于細(xì)胞膜表面。 本研究的第二部分研究了NR2A亞單位單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)膜表面表達(dá)。以往研究表明，在異源細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染NR2A亞單位不能獲得細(xì)胞膜表面表達(dá)，也不能檢測(cè)到有功能的受體通道，NR2A必須與NR1形成異聚體，才能形成有功能的受體通道。我們用GFP-NR2A單獨(dú)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)200nMPMA(PKC激動(dòng)劑)孵育30min后，用抗GFP抗體

5、做活細(xì)胞表面染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4.1±1.5％轉(zhuǎn)染細(xì)胞(表達(dá)有綠色熒光蛋白)表面染色陽性，即GFP-NR2A獲得了細(xì)胞膜表面表達(dá)，而未經(jīng)PMA處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞則無陽性染色，提示PKC的激活可以促進(jìn)NR2A向細(xì)胞膜的運(yùn)輸。我們進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染C末端部分缺失的NR2A，證明了NR2A亞單位的C末端1149D-1464V區(qū)域可能介導(dǎo)了這一作用。然而，表面表達(dá)有NR2A的HEK293細(xì)胞采用全細(xì)胞膜片鉗法并未能記錄到谷氨酸誘發(fā)的電流，也尚不能確認(rèn)表面表

6、達(dá)的NR2A亞單位是單體形式還是同聚體。 本研究的第三部分，我們研究了PSD95對(duì)NR2A膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)GFP-PSD95與NR2A共表達(dá)于HEK293細(xì)胞時(shí)，部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞(13.2±3.1％)的胞漿中具有一些GFP-PSD95和NR2A高密度且共定位的區(qū)域，這些區(qū)域同時(shí)也能被高爾基體特異性染料(GolgiTracker)和早期內(nèi)體抗體EEA1所標(biāo)記，提示可能是相應(yīng)的亞細(xì)胞器。而且，經(jīng)1mMPMA孵育后含有這種GFP-