ABCB1遺傳多態(tài)性和表觀遺傳學(xué)差異對P-糖蛋白功能的影響.pdf

1、一、目的 1.研究健康漢族人中ABCB1基因多態(tài)性與啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度的分布特征及兩者間的相關(guān)性。 2.研究健康漢族人ABCB1基因多態(tài)性和啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平對P-糖蛋白功能的影響。 3.比較選擇不同劑量的探藥對P-糖蛋白功能評價(jià)的影響。 4.初步探討人外周血ABCB1基因多態(tài)性和啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度對抗癲癇藥物穩(wěn)態(tài)腦脊液濃度的影響。 二、方法 1.健康漢族志愿者ABCB1基因多態(tài)性分

2、析方法的建立 207名健康受試者參加了本試驗(yàn)。采集受試者外周靜脈全血2mL，利用本試驗(yàn)室改良的少量血樣DNA快速抽提法提取genomicDNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對位于ABCB1基因11、12、21和26號外顯子區(qū)域的G1199A、C1236T、G2677T/A以及C3435T幾個(gè)重要位點(diǎn)進(jìn)行基因多態(tài)性分析，并通過DNA直接測序來確認(rèn)基因分型結(jié)果。 2.健康漢族人ABCB1啟動(dòng)

3、子區(qū)域甲基化檢測用結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(COBRA)對前述207名健康漢族人進(jìn)行ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化分析。1-2μgDNA稀釋至50μL，變性后經(jīng)亞硫酸氫鈉硫化處理，使DNA中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，經(jīng)PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶酶切后非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，EB染色后再進(jìn)行灰度掃描。 3.ABCB1基因多態(tài)性和啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度對P-糖蛋白功能的影響及不同劑量的探討 對P-糖蛋白功能評價(jià)的影響以

4、P-糖蛋白經(jīng)典探藥--地高辛為模型藥物，研究ABCB1基因多態(tài)性和啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度對P-糖蛋白功能的影響；并同時(shí)觀察了不同劑量水平的地高辛對P-糖蛋白功能評價(jià)的影響。地高辛血漿藥物濃度采用雅培微粒子酶免疫試劑盒(DigoxinⅡ-5B73)進(jìn)行定量測定。本試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.3～4.0ng.mL-1，最低定量限為0.3ng.mL-1，對超過4.0ng.mL-1的樣本稀釋后再進(jìn)行測定。 4.ABCB1基因多態(tài)性和啟動(dòng)子區(qū)

5、域甲基化程度對苯妥英鈉、苯巴比妥穩(wěn)態(tài)腦脊液濃度的影響 35名服用苯妥英鈉和40名服用苯巴比妥的神經(jīng)外科住院患者參與了本實(shí)驗(yàn)。在患者持續(xù)規(guī)律給藥達(dá)到7～10天后，同時(shí)采集其下次給藥前的血標(biāo)本6mL和腦脊液標(biāo)本2mL；其中2mL全血用于DNA抽提，另外4mL離心后保留血漿用于血中藥物濃度測定。分析ABCB1基因多態(tài)性和啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度與患者穩(wěn)態(tài)血漿、腦脊液藥物濃度及腦脊液/血漿藥物濃度比值間的相關(guān)性，考察ABCB1基因多態(tài)性和啟

6、動(dòng)子區(qū)域甲基化對苯妥英鈉和苯巴比妥穩(wěn)態(tài)腦脊液濃度的影響。 5.統(tǒng)計(jì)方法 所有統(tǒng)計(jì)均使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析。Hardy-Weinberg檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)。不同基因型之間的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度差異使用Kruskal-Wallis method和Mann-Whithey U檢驗(yàn)，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度的相關(guān)性分析使用Spearman法。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 三、

7、結(jié)果 1.ABCB1基因多態(tài)性在健康漢族人群中的分布 盡管在白種人中的突變發(fā)生頻率為6.5％～11％(最近，體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)G1199A的突變可以改變蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性)，但在207個(gè)健康漢族人中并沒有發(fā)現(xiàn)G1199A的突變等位基因存在。本研究進(jìn)一步證實(shí)了ABCB1的3個(gè)主要SNPs在中國人群中的基因頻率和單倍體型頻率。ABCB1C1236T、G2677T/A和C3435T在健康漢族志愿者中的突變發(fā)生頻率分別為66.6％、41

8、.6％、16.3％和40.4％，這些等位基因的發(fā)生頻率符合Hardy-Weinberg平衡。在健康漢族志愿者中，ABCB1的C3435T單核苷酸多態(tài)性的野生型純合子CC的頻率為35.1％，突變型純合子TT的頻率為15.9％，突變型雜合子CT的頻率為49.0％；ABCB1的C1236T單核苷酸多態(tài)性的野生型純合子CC的頻率為14.4％，突變型純合子TT的頻率為47.6％，突變型雜合子CT的頻率為38.0％；ABCB1的G2677T/A單核

9、苷酸多態(tài)性的野生型純合子GG的頻率為16.3％，突變型純合子中TT的頻率為16.8％，TA的頻率為10.6％，AA的頻率為4.8％，突變型雜合子GT的頻率為38.9％，GA的頻率為12.5％。利用SHEsis和Phase 2.1.1軟件對C1236T、G2677T/A和C3435T位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析和單倍體型構(gòu)建發(fā)現(xiàn)：位于26號外顯子的C3435T位點(diǎn)與12號外顯子C1236T位點(diǎn)和21號外顯子G2677T位點(diǎn)之間存在明顯的連鎖不平

10、衡關(guān)系；在健康漢族人中以T-T-T、C-G-C、T-G-C和C-A-C這四個(gè)單倍體型為主，占到90％以上。 2.健康漢族人ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度 在207個(gè)健康漢族人中，ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平中位數(shù)為13.2％(3.2％～28.7％)，男女之間沒有發(fā)現(xiàn)性別差異。此外，3435CC、3435CT和3435TT。型個(gè)體間ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平存在明顯差異，3435CC型個(gè)體甲基化水平較低，3435TT

11、個(gè)體最高；而G2677T/A野生型純合子個(gè)體相對于突變型純合子(TT、AA、TA)和雜合子(GT、GA)個(gè)體均表現(xiàn)出較低的甲基化水平，但在后兩者之間沒有明顯差異。在不同的單倍體型個(gè)體中，TTT攜帶者顯示出較非TTT攜帶者較高的甲基化程度，而TGC攜帶者顯示出較非TGC攜帶者較低的甲基化程度。 3.ABCB1基因多態(tài)性對不同劑量地高辛藥動(dòng)學(xué)的影響 受試者在口服低(0.25mg)、中(0.5mg)、高(0.75mg)三個(gè)劑量

12、水平的探藥后，其AUC0-4、Cmax和Tmax除與劑量水平相關(guān)外，在不同ABCB1SNPs的個(gè)體中沒有明顯差異。然而，在將受試者按照所構(gòu)建的ABCB1單倍體型分組后，在0.25mg劑量組內(nèi)，TGC-CGC個(gè)體內(nèi)地高辛AUC0-4、Cmax明顯降低于TTT-TTT的個(gè)體。 4.ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平對不同劑量地高辛藥動(dòng)學(xué)的影響 在對ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度與不同劑量地高辛的AUC0-4、Cmax和Tmax進(jìn)

13、行相關(guān)性分析后，同樣發(fā)現(xiàn)ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平僅與0.25mg劑量組的AUC0-4和Cmax呈正相關(guān)，但沒有發(fā)現(xiàn)ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平與0.5mg和0.75mg劑量組AUC0-4和Cmax存在相關(guān)性。 5.ABCB1基因多態(tài)性和啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平對苯妥英鈉穩(wěn)態(tài)腦脊液濃度的影響 在35名服用苯妥英鈉的住院患者中發(fā)現(xiàn)：ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度與患者苯妥英鈉穩(wěn)態(tài)腦脊液/血漿濃度比值存在負(fù)相關(guān)，但并沒有發(fā)

14、現(xiàn)ABCB1單核苷酸多態(tài)性或其單倍體型對苯妥英鈉穩(wěn)態(tài)腦脊液或血漿濃度及兩者比值存在明顯影響。 6.ABCB1基因多態(tài)性和啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平對苯巴比妥穩(wěn)態(tài)腦脊液濃度影響 在40名使用苯巴比妥的住院患者中，沒有發(fā)現(xiàn)ABCB1 SNPs、單倍體型或者其啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平對苯巴比妥的穩(wěn)態(tài)腦脊液、血漿藥物濃度及腦脊液/血漿藥物濃度比值存在明顯影響。 四、結(jié)論 本研究首次發(fā)現(xiàn)位于11號外顯子的G1199A在中國健

15、康志愿者中不存在突變，說明該位點(diǎn)的突變存在明顯的地域或種族差異。實(shí)驗(yàn)所得中國漢族人ABCB1基因常見SNPs和主要單倍體型的發(fā)生頻率與其他實(shí)驗(yàn)室在中國人群中的研究結(jié)果基本一致，各等位基因頻率的分布符合Hardy-Weinberg平衡，研究資料具有群體代表性。 本研究首次對健康漢族志愿者ABCB1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平進(jìn)行了大樣本檢測，并發(fā)現(xiàn)ABCB1不同SNPs和單倍體型個(gè)體中啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平存在明顯差異。這提示ABCB1基因

16、多態(tài)性和表觀遺傳學(xué)差異間存在某種關(guān)聯(lián)，為探索ABCB1同義突變導(dǎo)致P-糖蛋白表型差異的機(jī)制提供了新的思路。 本研究觀察了地高辛給藥劑量的不同對P-糖蛋白功能評價(jià)的影響，并從基因多態(tài)性和表觀遺傳學(xué)差異兩方面證實(shí)了低劑量地高辛能夠更好的體現(xiàn)個(gè)體間P-糖蛋白功能的差異。這對以前研究所得的矛盾結(jié)果及以后的研究具有提示和借鑒意義。 本研究初步探討了ABCB1遺傳多態(tài)性和表觀遺傳學(xué)差異對苯妥英鈉、苯巴比妥穩(wěn)態(tài)腦脊液濃度的影響，僅發(fā)現(xiàn)