沉默Piwil2表達(dá)對子宮頸癌細(xì)胞增殖和衰老的影響.pdf

1、研究背景：
　　宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)第一位的惡性腫瘤，全球每年大約有500，000名新發(fā)病例，其中80％在發(fā)展中國家，我國每年大約有10000名新發(fā)病例，且近年來有年輕化趨勢，高危型HPV16、18感染作為宮頸癌的啟動因素對于促進(jìn)癌癥的發(fā)展有至關(guān)重要的作用。目前手術(shù)和放、化療是宮頸癌主要的治療手段，但并發(fā)癥、副作用、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥等使其具有局限性，迫切需要一種更為有效的治療方法來提高療效，以期達(dá)到治愈宮頸癌的目的。近年來隨著腫瘤

2、干細(xì)胞的研究，證實腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)的根源，因此尋找一種特異性表達(dá)在腫瘤干細(xì)胞中的基因作為靶點(diǎn)會為宮頸癌的治療帶來突破。
　　腫瘤干細(xì)胞的形成與發(fā)展主要與多種干胚胎基因、生殖干細(xì)胞基因和成體干細(xì)胞基因的是否重表達(dá)有關(guān)。雖然胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因如POU5f1（Oct-4)，Nanog，Lin28B，c-Myc和Sox2等可表達(dá)在腫瘤干細(xì)胞中，但其表達(dá)并不穩(wěn)定且具有爭議性，而生殖干細(xì)胞相關(guān)基因如 Piwil2可穩(wěn)定表

3、達(dá)在各種腫瘤的腫瘤干細(xì)胞中，同時Piwil2可促進(jìn)原癌基因或胚胎干細(xì)胞基因如c-Myc、Lin28B、Sox2等的表達(dá)并在腫瘤干細(xì)胞多步驟演變與分化中有重要作用，因此其可能作為腫瘤檢測、診斷、治療的一個重要標(biāo)記物。
　　Piwil2蛋白是AGO/PIWI蛋白家族的一種，正常情況下只表達(dá)在睪丸組織中，對于維持生殖干細(xì)胞的發(fā)育和配子的形成具有重要的作用。同時 Piwil2蛋白可特異性表達(dá)在多種腫瘤組織和細(xì)胞系的腫瘤干細(xì)胞，從而使腫瘤干

4、細(xì)胞具有自我更新和不斷增殖等異常的表觀遺傳特性和惡性轉(zhuǎn)化能力，有利于腫瘤的形成。
　　細(xì)胞衰老是細(xì)胞受體內(nèi)外多種因素的影響導(dǎo)致DNA斷裂損傷、氧自由基累積、端?？s短等致使生長代謝不可逆性停止的現(xiàn)象。主要受細(xì)胞色素依賴激酶抑制家族如 P16基因調(diào)控，導(dǎo)致相應(yīng)的端粒長度縮短及端粒酶活性降低等即細(xì)胞發(fā)生衰老，其中端粒的長度維持主要是由端粒逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT決定。在多種腫瘤中P16的表達(dá)常缺如而hTERT的活性增高，而恢復(fù)P16表達(dá)的增加

5、可抑制hTERT的表達(dá)。
　　目的：
　　沉默宮頸癌細(xì)胞中Piwil2基因的表達(dá)，觀察其對細(xì)胞增殖和衰老等生物學(xué)特性的影響，并進(jìn)一步探討其相關(guān)的分子學(xué)機(jī)制。
　　方法：
　　（1）Sh-piwil2質(zhì)粒采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染宮頸癌C33A和Hela細(xì)胞株，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 C33A-shPiwil2和HeLa-shPiwil2，沉默Piwil2基因的表達(dá)；熒光顯微鏡鏡檢、Q-

6、PCR和Western blot方法檢測Piwil2沉默效果。
　?。?）采用細(xì)胞增殖實驗檢測細(xì)胞增殖，集落形成實驗觀察細(xì)胞克隆形成能力。
　?。?）采用流式細(xì)胞周期檢測技術(shù)分析Piwil2沉默前后細(xì)胞周期分布的變化。
　?。?）采用β-半乳糖苷酶染色法檢測沉默Piwil2基因?qū)?xì)胞衰老的影響。
　?。?）運(yùn)用Q-PCR和Western blot方法檢測沉默Piwil2對P16和hTERT表達(dá)的影響。
　　

7、結(jié)果：
　　（1）建立C33A-shPiwil2和Hela-shPiwil2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；Q-PCR與Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組Piwil2 mRNA與蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　（2）細(xì)胞增殖實驗與集落形成實驗均證明：與對照組相比，沉默Piwil2組細(xì)胞生
　　長顯著抑制，集落形成能力下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。（3）細(xì)胞周期檢測結(jié)

8、果顯示：與對照組相比Piwil2沉默后細(xì)胞的G0/G1期比例增加，S期比例減少，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示：沉默 Piwil2組細(xì)胞衰老比例顯著增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　（5）Q-PCR與Western blot檢測P16和hTERT表達(dá)：與對照組相比，Piwil2沉默后細(xì)胞P16表達(dá)上升，而hTERT的表達(dá)下降（P<0.05）。
　　結(jié)