GRIM-19誘導子宮頸癌細胞中p53蛋白積聚的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，嚴重威脅著婦女健康和生命，目前，子宮頸癌發(fā)病率居高不下，且發(fā)病年齡趨于年輕化。高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）持續(xù)感染是子宮頸癌發(fā)生的最重要危險因素之一，尋找新的拮抗HR-HPV感染治療子宮頸癌的方法迫在眉睫。以基因治療為代表的生物治療目前已成為繼手術(shù)、化療、放療之后針對惡性腫瘤的第四種治療模式，其中基因治療是將目的基因用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導入靶細胞，使其表達此基因并獲得特定

2、的功能，繼而執(zhí)行或介導對腫瘤的殺傷和抑制作用，從而達到治療目的。目前，基因治療已成為子宮頸癌治療的新趨勢，然而有效的基因治療依賴于外源基因高效而穩(wěn)定的表達，因此，選擇合適、有效的靶基因成為目前針對子宮頸癌基因治療的首要任務(wù)。
　　 P53是抑癌基因，定位于17p13.1，全長16～20kb，編碼分子量為53kD由393個氨基酸組成的核內(nèi)磷酸化蛋白，在子宮頸癌組織中表達降低，且以野生型為主。野生型p53主要具有調(diào)節(jié)細胞周期、抑制腫

3、瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡等功能。具體主要通過調(diào)節(jié)p21基因的表達阻滯細胞周期，調(diào)控NFκB-Bcl-2途徑抑制細胞的生長，調(diào)節(jié)下游靶基因PUMA、NOXA、Perp來促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡。子宮頸癌細胞中HR-HPV編碼的E6蛋白通過抑制宿主細胞抑癌基因p53的功能，引起細胞癌變。因此，p53在子宮頸癌細胞中的表達降低或功能失活是子宮頸癌發(fā)病的重要因素之一。顯然，提高p53的表達或者恢復p53的功能是子宮頸癌治療的重要策略。
　

4、　 GRIMs（genes associated with retinoid-IFN-inducedmortality）是最近發(fā)現(xiàn)的一群參與干擾素（interferon，IFN）和維甲酸（retinoic acid，RA）合并誘導的細胞凋亡基因，是Kalvakolanu用反義RNA敲除技術(shù)在乳腺癌細胞中篩選鑒定并首先報道的凋亡蛋白。Grim-19屬GRIMs家族成員，是參與細胞線粒體的呼吸作用和調(diào)控細胞凋亡的新基因，定位于19 p13

5、.2，該區(qū)的多種基因為前列腺癌的抑制基因。編碼含144個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量約16kD，表達于人體多種正常組織中，主要定位在線粒體，細胞核也有少量表達。研究發(fā)現(xiàn)GRIM-19的表達促進了細胞的凋亡，其表達降低或位點突變可以導致細胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。許多腫瘤中，如甲狀腺腫瘤、腎癌、口腔癌、結(jié)直腸癌等中均發(fā)現(xiàn)GRIM-19表達的降低。STAT3在許多腫瘤中處于持續(xù)激活狀態(tài)，是腫瘤治療的新靶點。目前研究認為GRIM-19是STAT3

6、表達和激活的負性調(diào)節(jié)子，GRIM-19與其結(jié)合后，抑制其激活引起的下游基因的轉(zhuǎn)錄。但是GRIM-19在子宮頸癌細胞發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的具體作用尚不清楚。
　　 本課題組率先對子宮頸癌細胞中GRIM-19的表達及功能進行了相關(guān)研究。研究發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌組織中GRIM-19表達顯著降低，建立穩(wěn)定表達GRIM-19的HeLa細胞株，命名為HeLa/GRIM-19細胞，體內(nèi)體外實驗中均證實，GRIM-19具有抑制STAT3活性，阻滯細胞生

7、長，促進細胞凋亡的重要作用。鑒于之前研究結(jié)果已確定子宮頸癌組織中GRIM-19表達降低，且GRIM-19具有抑制子宮頸癌細胞生長，促進其凋亡的作用；而p53蛋白在子宮頸癌的發(fā)病機制中具有重要抗腫瘤、促細胞凋亡作用。因此，我們探討了子宮頸癌細胞中GRIM-19對p53基因表達的影響。發(fā)現(xiàn)，GRIM-19表達的恢復具有誘導p53蛋白積聚的作用，并且積聚的p53蛋白具有抑制子宮頸癌細胞增殖的功能。
　　 目的:
　　 研究GR

8、IM-19對p53基因表達的影響及分子機制，為子宮頸癌的治療提供理論依據(jù)及治療線索。
　　 方法:
　　 ⑴采用Western Blot方法檢測瞬時轉(zhuǎn)染pGRIM-19后子宮頸癌細胞株HeLa細胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表達；⑵使用siRNA沉默GRIM-19后，采用Western Blot方法檢測子宮頸癌細胞株HeLa細胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表達；⑶采用Western Blot方

9、法檢測瞬時轉(zhuǎn)染pGRIM-19后子宮頸癌細胞株SiHa、CaSki細胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表達；⑷使用siRNA沉默GRIM-19后，采用Western Blot方法檢測子宮頸癌細胞株SiHa、CaSki細胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表達；⑸采用Western Blot方法檢測瞬時轉(zhuǎn)染pGRIM-19或GRIM-19 siRNA后卵巢癌細胞株HO8910細胞中p53蛋白的表達；⑹使用Thymidine同步化后，采用

10、流式細胞儀檢測穩(wěn)定表達GRIM-19的HeLa細胞周期的變化；⑺采用FQ-PCR方法檢測瞬時轉(zhuǎn)染pGRIM-19后HeLa細胞中p53 mRNA的表達；⑻采用報告基因檢測瞬時轉(zhuǎn)染pGRIM-19后HeLa細胞中p53啟動子的激活情況；⑼使用siRNA沉默STAT3后，采用Western Blot 檢測HeLa、SiHa細胞中p53蛋白的表達；⑽采用Western Blot 檢測瞬時轉(zhuǎn)染STAT3C及STAT3DN后子宮頸癌細胞株HeLa

11、、SiHa細胞中p53蛋白的表達；⑾使用CHX處理后采用Western Blot檢測穩(wěn)定表達GRIM-19的HeLa細胞中p53蛋白半衰期的變化。
　　 結(jié)果:
　　 ⑴Western Blot檢測結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染pGRIM-19后HeLa細胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表達較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，p<0.05；⑵Western Blot檢測結(jié)果顯示通過siRNA沉默GRIM-19后HeLa細胞

12、中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表達較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義，p<0.05；⑶Western Blot檢測結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染pGRIM-19后SiHa、CaSki細胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表達較對照組明顯升高；⑷Western Blot檢測結(jié)果顯示通過siRNA沉默GRIM-19后SiHa、CaSki細胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表達較對照組明顯下降；⑸Western Blot檢測結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染p

13、GRIM-19或GRIM-19 siRNA后HO8910細胞中p53蛋白的表達較對照組均無明顯變化；⑹流式細胞儀檢測結(jié)果顯示穩(wěn)定表達GRIM-19的HeLa細胞周期較對照組細胞明顯阻滯于G1期；⑺FQ-PCR檢測結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染pGRIM-19后p53 mRNA表達水平較對照組則無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義，p>0.05；⑻報告基因檢測結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染pGRIM-19后p53的啟動子較對照組無明顯激活，差異無統(tǒng)計學意義，p>0.05；⑼

14、Western Blot檢測結(jié)果顯示通過siRNA沉默STAT3后HeLa、SiHa細胞中p53蛋白表達較對照組無明顯變化；⑽Western Blot檢測結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染STAT3C及STAT3DN后HeLa、SiHa細胞中p53蛋白表達較對照組無明顯變化；⑾CHX處理后Western Blot檢測結(jié)果顯示穩(wěn)定表達GRIM-19的HeLa細胞中p53蛋白的半衰期較對照組細胞顯著延長，差異有統(tǒng)計學意義，p<0.05。
　　 結(jié)論: