2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對(duì)學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其影響長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的機(jī)制研究.pdf

1、2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對(duì)學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其影響長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的機(jī)制研究
　　 阿爾茨海默氏病(Alzheimer’sdisease，AD)又稱老年癡呆，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的退行性疾病，其典型特征為病人進(jìn)行性記憶缺失，并發(fā)生行為、語言、視覺空間障礙。AD已經(jīng)成為繼心血管疾病、癌癥和腦卒中之后，嚴(yán)重危害老年人健康的主要疾病。其病理學(xué)改變主要包括神經(jīng)元的丟失及神經(jīng)突觸體的減少、含有Tau蛋白的神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofi

2、brillarytangles，NFT）和Aβ沉積形成的老年斑(senileplaque，SP)。目前用于AD治療的藥物只能改善其認(rèn)知功能障礙和行為癥狀，但不能治愈和停止病情發(fā)展。
　　 2-（α-羥基戊基）苯甲酸鉀鹽(Potassium2-(1-Hydroxypentyl)-benzoate，dl-PHPB）是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所自行設(shè)計(jì)合成的全新化合物，并已被國(guó)家食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)為抗缺血性腦卒中新藥。它是抗缺血性腦卒中

3、藥丁基苯酞（3-n-butylphathlide，dl-NBP）的前體，在體內(nèi)可以通過PH值改變或生物酶系統(tǒng)作用轉(zhuǎn)化為丁基苯酞而發(fā)揮其藥效學(xué)作用。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，dl-PHPB不僅具有顯著的抗腦缺血作用，還對(duì)慢性腦低灌注大鼠,Aβ誘導(dǎo)的癡呆大鼠及快速老化小鼠的認(rèn)知缺陷有改善作用。為了進(jìn)一步明確dl-PHPB改善學(xué)習(xí)記憶的作用，并探討其作用機(jī)制，本研究觀察了dl-PHPB對(duì)生理狀態(tài)下及化學(xué)誘發(fā)學(xué)習(xí)汜憶障礙的病理狀態(tài)下，大鼠海馬長(zhǎng)時(shí)程增

4、強(qiáng)(long-termpotentiation，LTP)的作用，并且在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)一步證實(shí)了dl-PHPB改善認(rèn)知功能及神經(jīng)突觸損傷的作用。
　　 第一部分:2-（α-羥基戊基）苯甲酸鉀鹽對(duì)麻醉大鼠海馬LTP的影響
　　 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高度可塑性，被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，其核心包括突觸連接的結(jié)構(gòu)和功能的可塑性。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-termpotentiation，LTP)，是指在條件刺激下誘發(fā)

5、的突觸傳遞功能的長(zhǎng)時(shí)間增強(qiáng)現(xiàn)象，它是突觸傳遞功能可塑性的重要表現(xiàn)形式，是在突觸水平上研究學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)機(jī)制的理想模型。許多病理因素均可以影響動(dòng)物腦內(nèi)LTP水平。因此，觀察藥物對(duì)LTP的影響對(duì)于了解藥物在神經(jīng)突觸可塑性方面的作用具有重要意義，可為闡明藥物改善認(rèn)知功能的機(jī)制提供重要實(shí)驗(yàn)證據(jù)。為此，我們依據(jù)經(jīng)典的HFS誘發(fā)的LTP記錄方法，在本實(shí)驗(yàn)室建立了麻醉大鼠海馬LTP實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，觀察dl-PHPB對(duì)生理狀態(tài)下及各種化學(xué)因素誘發(fā)的學(xué)習(xí)記憶障礙

6、病理狀態(tài)下由大鼠穿通纖維(perforantpathway,PP)至齒狀回(dentategyrus，DG)顆粒細(xì)胞層神經(jīng)通路（即PP-DG通路）LTP的影響。
　　 我們首先觀察了dl-PHPB對(duì)正常生理狀態(tài)下LTP的影響。10μMdl-PHPB可以在并不影響基礎(chǔ)突觸傳遞水平的情況下，顯著增強(qiáng)高頻刺激(highfrequencystimulation，HFS)誘發(fā)的LTP，此作用可持續(xù)至少60min。為了進(jìn)一步探討dl-PHP

7、B所致的LTP增強(qiáng)現(xiàn)象的可能機(jī)制，在給予10μMdl-PHPB前10min，側(cè)腦室注射NMDA受體拮抗劑D-APV，結(jié)果顯示D-APV150μM幾乎完全阻斷了dl-PHPB所致的LTP增強(qiáng)現(xiàn)象，其LTP誘發(fā)水平與單純給予D-APV150μM基本一致。然而在給予dl-PHPB前l(fā)0min注射非NMDA受體拮抗劑DNQX并不能完全阻斷dl-PHPB所致的LTP增強(qiáng)現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，dl-PHPB介導(dǎo)的LTP增強(qiáng)作用可能通過NMDA受體發(fā)揮

8、作用。
　　 之后，我們主要探討了dl-PHPB在各種化學(xué)因素誘發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙模型中的作用。
　　 東莨菪堿是非選擇性M膽堿受體拮抗劑，由于其可模擬膽堿能功能低下導(dǎo)致的癡呆，在抗癡呆藥物的評(píng)價(jià)中得到廣泛應(yīng)用。在東莨菪堿所致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷實(shí)驗(yàn)中，東莨菪堿模型組大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶和空間定向能力障礙，口服給予dl-PHPB100mg/kg或加蘭他敏2.5mg/kg可明顯改善東莨菪堿所致的學(xué)習(xí)能力和記憶損傷

9、。LTP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，東莨菪堿可以顯著抑制大鼠海馬PP-DG通路LTP水平，損傷神經(jīng)突觸傳遞效率?？诜o予dl-PHPB100mg/kg對(duì)東莨菪堿所致神經(jīng)傳遞損傷有明顯改善作用。
　　 細(xì)胞外由Aβ沉積而形成的老年斑是阿爾茨海默病的主要病理特征之一。β-淀粉樣蛋白（Aβ)是由其前體APP蛋白剪切加工而成，其主要的存在形式有Aβ40和Ap42，且這兩種形式的Aβ在AD病人腦中都有明顯升高。近年來，越來越多的研究表明，寡聚體形式的A

10、β具有更強(qiáng)的神經(jīng)細(xì)胞毒性，并且可以明顯抑制腦內(nèi)LTP水平。因此，我們建立了Aβ1-42誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)損傷模型，發(fā)現(xiàn)寡聚體Aβ1-42可對(duì)HFS誘導(dǎo)的大鼠海馬PP-DG通路LTP產(chǎn)生明顯的抑制作用，而口服dl-PHPB可顯著改善Aβ1-42所致LTP損傷。
　　 慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)普遍存在于AD患者腦內(nèi)，是神經(jīng)退行性病變的重要因素。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分，可以作為非特異免疫刺激物質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)。有研究表明

11、，LPS及其引起的炎癥反應(yīng)可影響腦內(nèi)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，并且可以造成海馬LTP損傷。因此，我們建立了LPS誘導(dǎo)的損傷模型，觀察腹腔注射LPS對(duì)大鼠海馬LTP的影響。結(jié)果表明，在LPS注射1天，大鼠海馬LTP水平有下降趨勢(shì)，LPS注射3天和30天后，LTP水平有顯著的降低，說明LPS對(duì)大鼠海馬突觸傳遞效率有明顯的損傷作用。而口服dl-PHPB并不能明顯改善LPS注射引起的大鼠海馬LTP損傷。
　　 綜上所述，本部分研究提示，dl-

12、PHPB可能通過影響NMDA受體而增強(qiáng)生理狀態(tài)下大鼠海馬LTP水平，并且口服dl-PHPB可以拮抗膽堿能系統(tǒng)損傷及Aβ?lián)p傷造成的LTP抑制作用。
　　 第二部分:2-(α-羥基戊基）苯甲酸鉀鹽對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶及LTP改善的機(jī)制研究
　　 遺傳因素是AD的主要發(fā)病機(jī)制之一，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)多種基因與AD相關(guān)，如β淀粉樣蛋白前體(APP)基因，早老素1(PS1)基因，早老素2(PS2)基因及載脂蛋白E(apoE)

13、基因等。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟發(fā)展，各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于AD的疾病研究和治療藥物評(píng)價(jià)。其中，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Ap沉積的量多，分布廣，并且神經(jīng)變性及行為學(xué)改變明顯，是研究AD病理機(jī)制較為理想的動(dòng)物模型。在本部分研究中，我們采用13月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，口服給予dl-PHPB（100mg/kg）一個(gè)月后，通過觀察各組動(dòng)物的被動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶能力、高頻刺激誘發(fā)的LTP水平及動(dòng)物腦組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，探討d

14、l-PHPB對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其可能機(jī)制。
　　 被動(dòng)回避行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型對(duì)照組相比，14月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的跳臺(tái)潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤數(shù)明顯升高；給予dl-PHPB的轉(zhuǎn)基因小鼠，與轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比，其跳臺(tái)潛伏期顯著延長(zhǎng)，錯(cuò)誤數(shù)明顯減少，說明口服dl-PHPB可以改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　 神經(jīng)電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型對(duì)照組相比，14月齡APP

15、/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬LTP水平顯著降低，給予dl-PHPB后，轉(zhuǎn)基因小鼠的LTP水平明顯升高；并且與野生型對(duì)照組小鼠相比，給予dl-PHPB后，野生型小鼠的LTP水平也有增加的趨勢(shì)。這說明口服dl-PHPB可以改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的突觸傳遞損傷。
　　 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬組織中，NMDAR1亞基和磷酸化NR2B(Tyr1472)蛋白表達(dá)水平均有明顯降低，這可能與轉(zhuǎn)基因模型組動(dòng)物學(xué)習(xí)

16、記憶能力和LTP水平下降有關(guān)?？诜l-PHPB可以改善磷酸化NR2B(Tyr1472)蛋白表達(dá)水平，從而提高APP/PS1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力和LTP水平。
　　 在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中，鉀離子通道蛋白表達(dá)水平也發(fā)生了變化。在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中,與野生型小鼠相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的Kv3,4蛋白表達(dá)水平顯著升高，并且口服dl-PHPB后轉(zhuǎn)基因小鼠的Kv3.4蛋白表達(dá)水平有明顯降低。

17、r>　　 與野生型小鼠相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬組織Kir6.1蛋白表達(dá)水平有顯著升高，口服dl-PHPB后，轉(zhuǎn)基因小鼠的Kir6.1蛋白表達(dá)水平有明顯降低，其表達(dá)水平與野生型對(duì)照組基本一致。
　　 與野生型小鼠相比，皮層和海馬組織中Kv2.1、Kv3.1的表達(dá)水平均沒有明顯改變，口服dl-PHPB對(duì)皮層組織Kv2.1表達(dá)有降低的趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？傮w而言，APP/PS1遺傳因素的改變并沒有影響Kv2.1及Kv