H2S對(duì)甲醛損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的改善作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的：
　　目前已證實(shí)，當(dāng)甲醛(formaldehyde, FA)過量累積在體內(nèi)，會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引發(fā)神經(jīng)毒性，造成學(xué)習(xí)記憶減退和認(rèn)知功能損傷。而硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)是一種新型神經(jīng)調(diào)質(zhì)，具有抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用，并可調(diào)節(jié)突觸可塑性。因此，我們推測H2S對(duì)甲醛損傷學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能具有拮抗作用。
　　腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurophic fa

2、ctor, BDNF)是腦內(nèi)合成的一種小分子蛋白，在神經(jīng)元的存活、分化及突觸可塑性調(diào)節(jié)中起重要作用，參與大腦的學(xué)習(xí)記憶調(diào)控?；诖?，我們將從BDNF的角度探討H2S抗甲醛損傷學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的機(jī)制。
　　為此，本研究將通過大鼠側(cè)腦室注射甲醛建立甲醛神經(jīng)染毒模型，探討 H2S對(duì)甲醛損傷學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的拮抗作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能；新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)分析大鼠的認(rèn)知功能；HE染色法

3、檢測大鼠大腦內(nèi)神經(jīng)元的狀態(tài)、排列及數(shù)量；Tunel(Terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling)法檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡；Elisa法檢測大鼠腦組織中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase;SOD)和丙二醛(Malondialdehyde;MDA)的含量；Western blot和免疫組化檢測BDNF蛋白的表達(dá)；Wes

4、tern blot法檢測腦組織中CBS蛋白表達(dá)；亞甲基藍(lán)分光光度計(jì)法分別檢測腦組織H2S的生成。
　　結(jié)果：
　　1.甲醛對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的損傷作用及其機(jī)制大鼠側(cè)腦室微注射2.5μL不同濃度的FA，連續(xù)7d。水迷宮實(shí)驗(yàn)和新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)分別檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和認(rèn)知功能。水迷宮定位航行訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FA(10μM)可使大鼠的游泳路線曲折、并顯著延長大鼠定位航行的潛伏期；水迷宮空間搜索訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FA(1,10

5、μM)明顯減少大鼠過原平臺(tái)的次數(shù)及在中環(huán)游泳的時(shí)間比；新穎物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)顯示FA(1,10μM)明顯降低大鼠的物體識(shí)別指數(shù)。上述結(jié)果表明甲醛可破壞大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和認(rèn)知功能。
　　行為學(xué)檢測結(jié)束后，部分大鼠取腦組織行HE染色和Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示FA(10μM)可使大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少、排列疏散，神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，提示甲醛對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的損害作用與其損傷神經(jīng)細(xì)胞有關(guān)。
　　行為學(xué)檢測結(jié)

6、束后，Elisa法檢測大鼠腦組織SOD和MDA的含量，結(jié)果顯示FA(0.1,1,10μM)呈濃度依賴性地增加MDA含量和降低SOD水平。提示甲醛的神經(jīng)毒性與其降低大鼠腦內(nèi)的抗氧化能力有關(guān)。
　　對(duì)大鼠海馬組織行Western blot檢測 CBS表達(dá)，結(jié)果顯示FA(0.1,1,10μM)顯著抑制海馬CBS的表達(dá)；亞甲基藍(lán)分光光度計(jì)法顯示FA(10μM)可顯著降低大鼠腦內(nèi)H2S的生成。以上提示FA通過抑制CBS表達(dá)和H2S的生成而降

7、低大鼠腦內(nèi)的抗氧化能力，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷，進(jìn)而損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能。
　　Western blot檢測大鼠腦組織BDNF蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示 FA(0.1,1,10μM)顯著降低大鼠腦組織BDNF蛋白的表達(dá)；免疫組化檢測大鼠腦組織石BDNF的表達(dá)也顯示10μM的FA能使大鼠海馬CA1區(qū)的BDNF陽性神經(jīng)元數(shù)量降低。這些結(jié)果表明FA損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能可能涉及到抑制BDNF的表達(dá)。
　　2.硫化氫對(duì)甲醛損傷大鼠學(xué)習(xí)

8、記憶與認(rèn)知功能的改善作用及其機(jī)制大鼠腹腔注射H2S供體NaHS(1.68,3.36,6.72mg/kg)7 h后，側(cè)腦室微注射10μM的FA(2.5μL)，連續(xù)7 d，進(jìn)行如下檢測：
　　水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，NaHS(1.68,3.36,6.72mg/kg)改善大鼠的游泳路線、并顯著恢復(fù)FA(10μM)處理的大鼠在定位航行訓(xùn)練第五天的潛伏期、空間搜索訓(xùn)練在中環(huán)的游泳時(shí)間比，新穎物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，NaHS(3.36,6.72

9、mg/kg)明顯改善FA(10μM)組大鼠的新物體識(shí)別指數(shù)。上述結(jié)果表明H2S對(duì)甲醛損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能具有改善作用。
　　HE染色結(jié)果顯示，NaHS(1.68,3.36,6.72mg/kg)改善了FA(10μM)導(dǎo)致的海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少和疏散無序的排列；Tunel染色結(jié)果顯示NaHS(1.68,3.36,6.72mg/kg)減輕了FA(10μM)對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的誘導(dǎo)作用，表明H2S對(duì)FA損傷神經(jīng)元具有拮

10、抗作用，提示H2S可通過減輕神經(jīng)元的損傷拮抗FA破壞大鼠的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能。
　　檢測大鼠腦組織中的SOD和MDA的含量，結(jié)果顯示NaHS(1.68,3.36,6.72mg/kg)可減輕FA(10μM)導(dǎo)致的大鼠腦組織中SOD含量的降低和MDA水平的升高，表明H2S能夠逆轉(zhuǎn)甲醛導(dǎo)致的大鼠機(jī)體抗氧化能力下降，提示H2S可通過增加腦組織抗氧化能力而減輕FA對(duì)神經(jīng)元的損傷，進(jìn)而改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能。
　　檢測腦組織 CB

11、S的表達(dá)和 H2S的生成，結(jié)果顯示 NaHS(1.68,3.36,6.72mg/kg)可逆轉(zhuǎn)FA(10μM)對(duì)大鼠腦組織CBS表達(dá)和H2S生成的抑制作用，提示外源性H2S能夠拮抗FA對(duì)CBS的抑制作用，增加腦內(nèi)H2S的生成，改善腦組織的抗氧化能力，從而減輕FA對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的損傷。
　　Western blot結(jié)果顯示NaHS(1.68mg/kg)顯著逆轉(zhuǎn)FA(10μM)對(duì)海馬BDNF表達(dá)的抑制作用；免疫組化檢測BDNF

12、的表達(dá)也觀察到NaHS(1.68,3.36,6.72mg/kg)能顯著增加FA(10μM)作用后的大鼠海馬CA1區(qū)BDNF陽性神經(jīng)元數(shù)量。表明，H2S可通過促進(jìn)BDNF蛋白的表達(dá)改善甲醛損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能。
　　結(jié)論
　　1. FA損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能，其機(jī)理可能與其抑制腦組織內(nèi)源性H2S的生成、降低腦組織抗氧化能力、誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷、以及下調(diào)海馬BDNF蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　2. H2S可改善FA對(duì)