SPR生物傳感器用于檢測(cè)兩種禽類病毒和轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab的研究.pdf

1、J亞群禽白血病病毒(ALV-J)和H9N2亞型禽流感病毒（H9N2 AIV）是兩種嚴(yán)重危害世界各國(guó)包括我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)，并對(duì)其造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的禽類病毒。目前這兩種病毒的傳統(tǒng)檢測(cè)方法大都存在處理周期長(zhǎng)、成本高，有時(shí)檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性等缺點(diǎn)。另外，轉(zhuǎn)基因作物的大量種植造成了生態(tài)系統(tǒng)方面的擔(dān)憂，轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類的健康是否具有危害也存在較大爭(zhēng)議。而當(dāng)前現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因蛋白的檢測(cè)技術(shù)存在著操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、成本高、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性差的缺點(diǎn)。因此，本文

2、將采用具有免標(biāo)記樣品、實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)、靈敏快速檢測(cè)的突出特點(diǎn)的表面等離子體共振(SPR)生物傳感器檢測(cè)這兩種禽類病毒和轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab。同時(shí)為了提高構(gòu)建的SPR生物傳感器的靈敏度，使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，Au/Ag復(fù)合納米粒子和三角Ag納米片作為增敏材料被引入傳感器中。本文包括以下三部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。
　　(1)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩種SPR生物傳感器——傳統(tǒng)模式生物傳感器和Au/Ag復(fù)合納米粒子增敏的生物傳感器用于檢測(cè)ALV-J。前者借助Au-

3、S鍵使3-巰基丙酸(MPA)在SPR裸金膜芯片上形成一層密集的自組裝單分子層，通過(guò)氨基與MPA中被活化劑活化后的羧基結(jié)合使蛋白A修飾到芯片上，接著芯片被乙醇胺滅活后，ALV-J抗體的非抗原結(jié)合位點(diǎn)與蛋白A結(jié)合使抗體修飾到芯片上，最后實(shí)現(xiàn)了對(duì)ALV-J抗原的檢測(cè);后者借助Au-S鍵使1，6-己二硫醇(HDT)一端在裸芯片上形成一層密集的自組裝單分子層，另一端借助Au-S鍵、Ag-S鍵使Au/Ag復(fù)合納米粒子修飾到芯片上，接下來(lái)傳感器修飾各

4、種物質(zhì)與檢測(cè)的方法同前者。結(jié)果兩種傳感器均能成功檢測(cè)ALV-J抗原，檢測(cè)限分別是1054 TCID50·mL-1和659 TCID50·mL-1，說(shuō)明將Au/Ag復(fù)合納米粒子引入SPR生物傳感器中可有效提高傳感器的靈敏度。而且進(jìn)行的對(duì)比實(shí)驗(yàn)展現(xiàn)了制備的傳感器具有良好的特異性。
　　(2)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一種新型的SPR生物傳感器用于檢測(cè)H9N2 AIV。首先借助HDT將三角Ag納米片修飾到芯片上，然后依次在芯片上修飾MPA、蛋白A和兔抗

5、H9N2單克隆抗體，并最終實(shí)現(xiàn)對(duì)H9N2 AIV及裂解AIV的檢測(cè)。結(jié)果傳感器能順利檢測(cè)完整的H9N2 AIV，最低檢測(cè)濃度為103 ELD50·mL-1。裂解病毒的濃度在50～103 ELD50·mL-1范圍內(nèi)與SPR信號(hào)成線性關(guān)系，檢測(cè)限為28 ELD50·mL-1(S/N=3)。另外，此SPR生物傳感器還展現(xiàn)了良好的檢測(cè)特異性。
　　(3)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩種SPR生物傳感器（傳感器1和傳感器2）用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab。在

6、傳感器2的芯片上依次修飾HDT、Au/Ag復(fù)合納米粒子、MPA、蛋白A和鼠抗Cry1Ab單克隆抗體，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)C巧1Ab蛋白的檢測(cè)。傳感器1與傳感器2的構(gòu)建過(guò)程相比，不同點(diǎn)在于沒(méi)有先固定蛋白A而直接固定抗體。結(jié)果這兩種傳感器分別在Cry1Ab蛋白的濃度為10～500 ng·mL-1和8～1000 ng·mL-1時(shí)有良好的線性響應(yīng)，檢測(cè)限分別為5.0 ng·mL-1和4.8 ng·mL-1(S/N=3)。同時(shí)兩種生物傳感器均具有較高的特異