SPR生物傳感器用于胰島素樣生長因子-1受體信號通路蛋白相互作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)生物傳感器技術因其實時、快速、無需標記的特點已廣泛用于研究生物分子之間相互作用的動力學過程。本文采用SPR生物傳感器技術研究胰島素樣生長因子-1受體上游蛋白相互作用,研究內容包括:胰島素受體底物(insulin receptor substrate-1,IRS-1)和磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3-K

2、)與磷酸化或非磷酸化胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor receptor-1,IGF-1R)的結合解離動力學;Mg2+、Mn2+、ATP、激酶抑制劑染料木黃酮和槲皮素存在時,IRS-1和PI3-K與IGF-1R的相互作用變化;來源于IGF-1R的磷酸化多肽(IGF-1R多肽)對IRS-1/IGF-1R結合影響,并探討了IRS-1對PI3-K與IGF-1R直接結合的影響以及三者結合模型;建立基于

3、SPR傳感芯片表面的IGF-1R多肽的磷酸化-去磷酸化開關技術平臺,應用此技術平臺研究IGF-1R多肽與下游蛋白相互作用和酪氨酸激酶反應。論文工作得到以下結果:
   1.固定于CM5芯片表面的抗IGF-1Rα亞基單克隆抗體特異性地捕獲了過表達IGF-1R細胞裂解液中的IGF-1R,此捕獲的受體成功地用于與IRS-1和PI3-K的相互作用研究。
   2.IGF-1R受體磷酸化提高了其與IRS-1結合速率,引起IGF-1

4、R/IRS-1親和力增強10.8倍,Mg2+、Mn2+進一步提高了IRS-1與磷酸化IGF-1R的結合解離速率。激酶抑制劑染料木黃酮和槲皮素表現(xiàn)出與ATP相同的影響趨勢,分別使親和常數下降6.0、6.6和4.7倍。IGF-1R磷酸化多肽競爭性抑制IRS-1與IGF-1R的結合。
   3.PI3-K和IGF-1R可以直接結合,較之于非磷酸化受體,磷酸化的IGF-1R與PI3-K的親和常數增強了20.5倍,Mg2+進一步提高了PI

5、3-K與磷酸化IGF-1R的結合速率。ATP存在下兩者的親和力不變,但結合與解離速率常數都有所提高。激酶抑制劑染料木黃酮和槲皮素與ATP表現(xiàn)出不同的趨勢,兩者使PI3-K/IGF-1R的結合速率降低。通過PI3-K、IRS-1和抑制IRS-1與IGF-1R直接結合的IGF-1R多肽共孵育來研究IRS-1對PI3-K和IGF-1R結合的影響,IRS-1促進了PI3-K與IGF-1R的結合,表明三個蛋白質間兩兩之間可能都有相互作用。

6、   4.在激酶反應條件下,過表達IGF-1R的細胞裂解液使芯片表面的非磷酸化模擬受體多肽磷酸化,表現(xiàn)出一定的受體酪氨酸激酶-底物特異性、酪氨酸磷酸化水平-孵育時間依賴性、磷酸化水平檢測的抗體濃度依賴性、激酶抑制劑對磷酸化抑制的濃度依賴性。固相磷酸化多肽可用于與IRS-1相互結合研究。磷酸化多肽表面能被白細胞特異性抗原酪氨酸磷酸酶完全去磷酸化,且1 mM的磷酸酶抑制劑正釩酸鈉可抑制此去磷酸化過程,實現(xiàn)了傳感芯片表面的磷酸化-去磷酸開關

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